О чем расскажет анализ на антитела

Определение резус-фактора антирезусной сывороткой анти-д экспресс-методом (в пробирках без подогрева).

Для
проведения данного исследования
используется универсальная антирезусная
сыворотка для экспресс-метода (анти-Д).
Исследуемая кровь берется из пальца
или из флакона с консервированной кровью
непосредственно перед исследованием.
На дно пробирки наносят одну каплю
стандартной антирезусной сыворотки
для экспресс — метода и добавляют одну
каплю исследуемой крови. После чего
осторожными движениями добиваются,
чтобы образовавшаяся жидкость растекалась
по стеклу пробирки

Через 3 минуты после
внесения эритроцитов добавляют в
пробирку 2-3 мл физиологического раствора.
Пробирку осторожно переворачивают 3
раза. Затем читают результат

Наличие
глыбок агглютинатов свидетельствует
о содержании в эритроцитах резус-фактора.
В случае резус-отрицательной крови
агглютинация не наблюдается.

Подготовка к исследованию

Чтобы получить точный результата анализа, врачи рекомендуют соблюдать правила подготовки:

• Кровь для исследования берется утром, через восемь часов после последнего приёма пищи;/li>
• За двое суток до анализа нельзя употреблять жирную, острую и жареную пищу;
• Запрещено в течение нескольких дней употреблять алкоголь;
• Перед сдачей крови нельзя курить.

За две недели до забора материала прекращается прием лекарственных средств. В тех случаях, когда это невозможно, на направлении указывается название лекарства и принятая доза.

Результат анализа может быть искажен из — за приема антипаразитарных препаратов и антибиотиков, в таком случае врач назначит исследование повторно.

Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления
стандартных эритроцитов берут в
количестве 1-2 мл (и более, смотря по
потребности) в пробирки вместимостью
8-10 мл, содержащие изотонический раствор
лимоннокислого натрия (из расчета 0,25
мл на 1 мл крови). Пробирки нумеруют и
пишут на них фамилию и инициалы лица,
от которого взята кровь.

После взятия крови в
пробирки доливают доверху изотонический
раствор NaCl, затем содержимое их
перемешивают, центрифугируют и отсасывают
отмывную жидкость. Такое отмывание
повторяют дважды.

Можно брать кровь и
без стабилизатора. В этом случае после
свертывания крови обычно в пробирке
остается некоторое количество свободных
эритроцитов. Если этих эритроцитов
недостаточно, следует интенсивно
встряхнуть сверток для отделения
большего количества эритроцитов.
Полученные таким образом эритроциты
отмывают, как сказано выше.

Из отмытых эритроцитов
готовят 2% взвесь в других пробирках,
взятых по числу образцов стандартных
эритроцитов и так же пронумерованных.

Для приготовления 2%
взвеси в эти пробирки капают по 2,5 мл
(49 капель) изотонического раствора NaCl
и в каждую пробирку в соответствии с ее
нумерацией переносят одну каплю
эритроцитов. Содержимое пробирок
перемешивают для получения равномерной
2% взвеси эритроцитов, которая применяется
для исследования сыворотки.

13.6.2. Иммуноферментный метод, или анализ (ифа)

ИФА — выявление
антигенов с помощью соответствующих
им антител, конъюгирован-ных
с ферментом-меткой (пероксидазой хре­на,
бета-галактозидазой или щелочной
фос-фатазой). После соединения антигена
с ме­ченной ферментом иммунной
сывороткой в

смесь
добавляют субстрат/хромоген. Субстрат
расщепляется
ферментом, и изменяется цвет продукта
реакции — интенсивность окраски прямо
пропорциональна количеству связав­шихся
молекул антигена и антител.

Твердофазный
ИФА —
наиболее
распростра­ненный
вариант иммунологического теста, когда
один из компонентов иммунной реак­ции
(антиген или антитела) сорбирован на
твердом носителе, например в лунках
план­шеток из полистирола (рис. 13.11).

При определении
антител в лунки планше­ток с сорбированным
антигеном последова­тельно
добавляют сыворотку крови больного,
антиглобулиновую
сыворотку, меченную фер­ментом,
и субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после
добавления очередного компонента из
лунок удаляют несвязавшие-ся реагенты
путем тщательного промывания. При
положительном результате изменяется
цвет раствора хромогена. Твердофазный
но­ситель можно сенсибилизировать
не только антигеном, но и антителами.
Тогда в лунки с сорбированными антителами
вносят иско­мый
антиген, добавляют иммунную сыворот­ку
против антигена, меченную ферментом, а
затем субстрата для фермента.

Конкурентный
вариант ИФА: искомый
ан­тиген
и меченный ферментом антиген кон­курируют
друг с другом за связывание ог­раниченного
количества антител иммунной сыворотки.
Другой тест — искомые антитела

и
меченые антитела конкурируют друг с
дру­гом
за антигены.

ИФА
применяют
для диагностики вирус­ных,
бактериальных и паразитарных болезней
в
частности для диагностики ВИЧ-инфекций,
гепатита
В и др., а также определения гормо­нов,
ферментов, лекарственных препаратов и
других биологически активных веществ,
содержащихся
в исследуемом материале в ми­норных
концентрациях — 10’°—1012
г/л.

13.6.3.
Радиоиммунологический метод, или
анализ (РИА)

Высокочувствительный
метод, основанный на
реакции антиген—антитело с примене­нием
антигенов или антител, меченных
ра­дионуклидом
(l25J,
14С,
3Н,
51Сr
и др.). После их
взаимодействия отделяют образовавшийся
радиоактивный
иммунный комплекс и опре­деляют его
радиоактивность в соответствую­щем
счетчике (бета- или гамма-излучение):

интенсивность
излучения прямо пропорцио­нальна
количеству связавшихся молекул ан­тигена
и антител.

При
твердофазном
варианте
РИА один
из компонентов
реакции (антиген или антитела) сорбирован
на твердом носителе, например в лунках
микропанелей из полистирола. Другой
вариант
метода — конкурентный
РИА:
ис­комый
антиген и меченный радионуклидом антиген
конкурируют друг с другом за свя­зывание
ограниченного количества антител
иммунной
сыворотки. Этот вариант исполь­зуют
для определения количества антигена в
исследуемом
материале.

РИА
применяют
для выявления антигенов микробов,
определения гормонов, фермен­тов,
лекарственных веществ и иммуноглобу­линов,
а также иных веществ, содержащихся в
исследуемом
материале в минорных концент­рациях
— 10~12—
10~15
г/л. Метод представляет определенную
экологическую опасность.

13.6.4. Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг
(ИБ) — высокочувстви­тельный метод,
основанный на сочетании электрофореза
и ИФА или РИА.

Антиген
выделяют с помощью электрофоре­за
в полиакриламидном геле, затем переносят
его
(блоттинг — от англ. blot,
пятно)
из геля на активированную
бумагу или нитроцеллюлоз-ную
мембрану и проявляют с помощью ИФА.
Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»

антигенов.
На эти полоски наносят сыворотку
больного.
Затем после инкубации отмывают от
несвязавшихся антител больного и наносят
сыворотку против иммуноглобулинов
челове­ка,
меченную ферментом. Образовавшийся на
полоске комплекс антиген + антитело
больно­го
+ антитело против Ig
человека выявляют до­бавлением
субстрата/хромогена, изменяющего окраску
под действием фермента (рис. 13.12).

ИБ
используют как диагностический метод
при
ВИЧ-инфекции и др.

Методы, основанные на реакции преципитации

Основная модель реакции антиген-антитело
представлена преципитацией, в ходе
которой антиген из раствора осаждается
специфическими антителами. Комплекс
антиген-антитело выпадает в осадок
только при определенных соотношениях
концентраций реагирующих молекул.
Область этих соотношений, при которых
в надосадочной жидкости после образования
преципитата не обнаруживаются ни
свободные антигены, ни свободные
антитела, называется зоной эквивалентности.
Вне этой зоны, когда существует избыток
антител или антигена, феномен преципитации
не развивается, так как образуется
растворимый комплекс антиген-антитело.
Если в пробы с постоянной концентрацией
антител добавлять возрастающие количества
антигена и в образовавшихся, отмытых
физиологическим раствором преципитатах
определять содержание азота микрометодом
Къельдаля, можно получить количественное
выражение реакции преципитации. В
зависимости от вариантов постановки
преципитации выявляемое количество
антител колеблется от 2 до 18 мкг азота
белка антител в 2 мл.

Существуют
различные модификации постановки
реакции преципитации. Самый простой
способ – кольцепреципитация.

Методика.
В узкую пробирку (диаметр 0,5 см) наливают
0,3-0,5 мл неразведенной преципитирующей
сыворотки. Пастеровской пипеткой
медленно наслаивают по стенке (пробирку
держат в наклонном положении) антиген
в таком же объеме

Затем пробирку
осторожно, чтобы не смешать жидкости,
ставят вертикально. При правильном
наслоении антигена на сыворотку четко
видна граница между двумя слоями
жидкости

РП должна обязательно
сопровождаться контролями сыворотки
и антигена (рис.8.1)

Результаты реакции
учитывают в зависимости от вида антигена
и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через
20-24 ч. В случае положительной реакции в
опытной пробирке на границе между
сывороткой и исследуемым экстрактом
появляется преципитат в виде кольца
белого цвета.

Реакция
преципитации широко применяется в
лабораторной практике для диагностики
инфекционных заболеваний бактериальной
этиологии (сибирская язва, чума, острая
респираторная инфекция и др.).

В
судебной медицине РП используется для
определения видовой принадлежности
белка (кровавых пятен, спермы и т.д.).

С
помощью РП можно выявить не только
видовую, но и групповую специфичность
белка. С ее помощью, например, была
определена степень родства различных
видов животных и растений.

Применение
РП для санитарно-гигиенического контроля
пищевых продуктов позволяет выявить
фальсификацию мясных, рыбных, мучных
изделий, примеси в молоке и т.д.

Реакция
преципитации может быть поставлена в
агаровом геле (иммунодиффузия). Различают
простую и двойную иммунодиффузию. В
первом случае диффундирует один компонент
реакции, во втором оба. В зависимости
от того происходит ли диффузия по одной
общей оси, во все стороны радиально или
под углом иммунодиффузия называется
линейной, радиальной или угловой. Общая
схема методов представлена на рис. 2.

13.1. Реакции антиген—антитело

Особенности
взаимодействия антитела с ан­тигеном
являются основой диагностических
реакций
в лабораториях. Реакция invitroмеж­ду
антигеном и антителом состоит из
специ­фической и неспецифической
фазы. В специ­фическую
фазу происходит
быстрое специфи­ческое
связывание активного центра антитела
с детерминантой антигена. Затем наступает
неспецифическая
фаза —
более медленная, ко­торая
проявляется видимыми физическими
явлениями, например образованием
хлопьев (феномен агглютинации) или
преципитата в виде помутнения. Эта фаза
требует наличия определенных условий
(электролитов, опти­мального рН
среды).

Связывание
детерминанты антигена (эпито-па) с
активным центром Fab-фрагмента
анти­тел
обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами,
водородными
связями и гидрофобным взаимо­действием.
Прочность и количество связавше­гося
антигена антителами зависят от
аффин­ности,
авидности антител и их валентности.

Иммунные реакции
используют при диа­гностических и
иммунологических исследо­ваниях у
больных и здоровых людей. С этой целью
применяют серологические
методы (от
лат.
serum—
сыворотка и logos—
учение), т. е. методы
изучения антител и антигенов с помо­щью
реакций антиген—антитело, определяе­мых
в сыворотке крови и других жидкостях,
а также
тканях организма.

Обнаружение в
сыворотке крови боль­ного антител
против антигенов возбудите­ля
позволяет поставить диагноз болезни.
Серологические исследования применяют
также для идентификации антигенов
микро­бов, различных биологически
активных ве­ществ, групп крови,
тканевых и опухолевых антигенов,
иммунных комплексов, рецепто­ров
клеток и др.

При выделении
микроба от больного про­водят
идентификацию возбудителя путем изу-

чения его антигенных
свойств с помощью иммунных диагностических
сывороток, т. е. сывороток крови
гипериммунизированных животных,
содержащих специфические ан­титела.
Это так называемая серологическая
идентификация
микроорганизмов.

В микробиологии
и иммунологии широко применяются
реакции агглютинации, преци­питации,
нейтрализации, реакции с участи­ем
комплемента, с использованием меченых
антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий,
иммуноферментный, иммунофлюорес-центный
методы). Перечисленные реакции различаются
по регистрируемому эффекту и технике
постановки, однако, все они осно­ваны
на реакции взаимодействия антигена с
антителом и применяются для выявления
как антител,
так и антигенов. Реакции иммуните­та
характеризуются высокой чувствительнос­тью
и специфичностью.

Ниже приводятся
принципы и схемы ос­новных
иммунодиагностических реакций. Детальная
техника постановки реакций дана в
практических руководствах по
иммуноди­агностике.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

ПЦР выявляет предварительно усиленные (умноженные) нуклеотидные
последовательности специфичные для генома данного возбудителя. Широко
используется в исследовании ВИЧ для решения проблем, требующих детекции
геномного материала вируса в организме in vitro и в окружающей среде. Во всех
случаях из тотального препарата клеточной РНК, включающей и РНК вируса, если он
репродуцировался в клетке или был интегрирован в ее геном, с помощью обратной
транскрипции и гибридизации с мечеными олигонуклеотидными «зондами» получают

достаточное для анализа количество провирусной ДНК. Последнюю выявляют и
характеризуют количественно, как и в отношении принадлежности к геному ВИЧ, по
радиоактивной или иной метке зонда устанавливая гомологию ДНК и специфических
для вируса аминокислотных последовательностей. Метод имеет множество модификаций
для поиска геномного материала ВИЧ непосредственно в сыворотке крови. Можно
использовать для быстрого ВИЧ-скрининга образцов крови по наличию или отсутствию
в сыворотке ДНК-геномных последовательностей этого вируса.

Общая информация о проблеме

Антиспермальные антитела выступают против антигенов сперматозоидов. Говоря доступным языком, эти тела выступают как иммунологический фактор против сперматозоидов и вырабатываются в организме у мужчины и у женщины. Рассмотрим, как происходит появление проблемы в каждом случае.

Антиспермальные антитела у мужчины

У мужчин сперматозоиды не вырабатываются вплоть до начала полового созревания. Из-за этого иммунная не воспринимает тельца как свои и пытается вести борьбу с «инородными» телами. Если бы не наличие защиты у спермиев против клеток иммунной системы – мужчина был бы бесплоден от рождения.

Одним из механизмов защиты «живчиков» от своего же организма является барьер между семенными каналами и кровеносными сосудами. В норме кровь и сперматозоиды не соприкасаются, но при отклонении происходит попадание спермиев в кровь. В ответ на это организм запускает защитные механизмы и вырабатываются антиспермальные антитела.

Факторы, провоцирующие патологию:

• варикоцеле – заболевание, при котором расширяются вены, расположенные вокруг семенного канатика;
• перекрытие семявыводящих каналов опухолью или инородным телом;
• травмы с нарушением целостности внутренних кровеносных сосудов, расположенных рядом с мочеполовой системой;
• различного рода инфекции;
• крипторхизм – неопущение одного из яичка у новорожденного мальчика;
• хирургические вмешательства – при вазэктомии (перевязка семявыводящих протоков) одним из осложнений у 65% мужчин является появление антиспермальных антител.

Онкологические заболевания также становятся причиной возникновения этой проблемы.

В дальнейшем АСАТ связываются с антигенами, расположенными на головке сперматозоида и блокируют рецепторы, отвечающие за прикрепление спермия к яйцеклетке женщины. В итоге внешне при половом акте нет никаких отклонений, происходит эякуляция, но из-за заблокированных рецепторов оплодотворения не происходит.

При другом варианте развития событий, антиспермальные антитела связываются с антигенами, расположенными на хвосте сперматозоида. Как результат – «головастик» теряет подвижность и не может достичь женской яйцеклетки.

Антиспермальные антитела у женщин

В организме мужчины АСАТ может и не быть, но при возникновении ряда факторов они начинают вырабатываться в крови у женщин. Для организма прекрасной половины человечества сперматозоиды являются в прямом смысле инородными телами. Если нет патологий, то защитным барьером выступает слизистая оболочка влагалища, перекрывающая доступ сперматозоидов к кровеносной системе женщины.

При возникновении воспалительных заболеваний женских половых органов защитный барьер разрушается, сперматозоиды соприкасаются с кровью. В ответ организм начинает вырабатывать иммунные тела (АСАТ), изменяется функционирование слизистой оболочки влагалища. Вместо того, чтобы вырабатывать слизь, необходимую для продвижения сперматозоида к яйцеклетке, организм создает оружие против «головастиков». В итоге при соприкосновении со слизистой оболочкой женского полового органа сперматозоиды теряют подвижность и гибнут. Оплодотворения не происходит.

Преимущества методики

Бесспорными преимуществами данной методики исследования считаются ее специфичность и высокая чувствительность. Чувствительность означает возможность распознать искомый элемент, даже если его содержание в образце невысокое. Специфичность подразумевает безошибочность диагностирования: если результаты положительные, значит, обнаружены именно те антитела или антигены, которые предполагались.

Высокая степень технологичности осуществления иммуноферментного анализа методом титрования минимизирует воздействие человеческого фактора, что существенно уменьшает вероятность ошибки. Основная масса используемых в современных клиниках реактивов и тест-систем для ИФА производятся в промышленных условиях, что гарантирует достоверный результат.

Техника исследования

а. В штатив устанавливают
пробирки вместимостью 8-10 мл, которые
нумеруют. Число и нумерация пробирок
должны соответствовать числу и нумерации
образцов эритроцитов, с которыми
исследуется сыворотка.

б. Во все пробирки
вводят по две капли исследуемой сыворотки.

в. Согласно нумерации
в пробирки вводят по одной капле
стандартных эритроцитов.

г. Во все пробирки
вводят по одной капле 33% раствора
полиглюкина.

д. Пробирки встряхивают
для перемешивания их содержимого, затем
наклоняют почти до горизонтального
положения и медленно поворачивают по
горизонтальной оси так, чтобы содержимое
растекалось по их стенкам. Контакт
эритроцитов с исследуемой сывороткой
при поворачивании пробирок продолжают
три минуты.

е

Через 3-5 минут в
пробирки наливают 3-4 мл изотонического
раствора NaCl, осторожно перемешивают
содержимое путем 2-3 — кратного перевертывания
пробирки (не взбалтывать!) и наблюдают
результат в виде наличия или отсутствия
агглютинации эритроцитов