Алгоритм определение группы крови по стандартным сывороткам

Определение резус-принадлежности

Определение резус-принадлежности
заключается в выявлении в эритроцитах
крови человека наличия или отсутствия
особого белка (антигена), названного
резус-фактором.

Выделяют три разновидности
резус‑антигена: D, С, Е

Наи­большей
активностью обладает антиген D, поэтому
именно его определение имеет важное
значение. Группы крови, в которых
содержится антиген Rh(D), условно принято
считать резус-поло­жительными (Rh+), а
группы крови, не содержащие антигена
Rh(D), — резус-отрицательными (Rh-)

Для определения резус-фактора
в настоящее время использу­ют
стандартную сыворотку, содержащую
определенный титр аг­глютининов или
цоликлон анти-D.

Действующим началом цоликлона
анти-Dявляются антитела,
принадлежащие к классу иммуноглобулинов
М. Они вызываютпрямую
агглютинацию эритроцитов, содержащих
резус-фактор.

На пластину со смачиваемой
поверхностью нано­сится большая капля
(около 0,1 мл) реагента, рядом помещается
маленькая капля
(0,01—0,05 мл) исследуемой крови. Затем
кровь смешивается
с реагентом. Реакция агглютинации
начинается через 10 — 15 с, четко выраженная
агглютинация наступает через 30 — 60 с.

Использование
подогретой до температуры 37 ‑ 40 °С
пластинки со­кращает
время наступления агглютинации.
Результаты реакции учи­тывайте
через 3 мин. Пластинку после смешивания
реагента с кро­вью
покачивают не сразу, а через 20 — 30 с,
что позволяет за это время развиться
более полной крупнолепестковой
агглютинации.

3.2.1. Определение группы крови с помощью стандартных гемагглютинирующих сывороток

На
основании реакции агглютинации
эритроцитов установлено, что кровь
каждого человека принадлежит к одной
из четырех групп. Кровь различных групп
отличается наличием агглютининов и
агглютиногенов. Агглютинины (склеивающие
вещества) находятся в плазме. Агглютиногены
– вещества, способные склеиваться,
содержатся в эритроцитах.

Имеются
два вида агглютиногенов – А и В и
соответственно два вида агглютининов
– 
и .
Реакция агглютинации, т. е. склеивание
эритроцитов, наступает лишь при смешении
одноименных агглютининов и агглютиногенов,
например 
и А или 
и В. Агглютинацию нельзя смешивать с
процессом свертывания крови – выпадением
фибрина в виде нерастворимых нитей.

Определение
группы крови имеет практическое значение
для переливания крови. При этом
учитывают, прежде всего, свойства
эритроцитов донора, так как плазма
вводится в малом количестве и, разводясь
в крови реципиента, теряет свои
агглютинирующие качества. Однако при
переливании значительного
количества
крови, учитывают и агглютинины донора.

Для
работы необходимы:
донорская кровь, стандартные сыворотки
I,
II
и III
групп двух
разных серий,
предметные стекла (чашка Петри), пипетки,
стеклянные палочки.

Проведение
работы.
Группы крови определяют по свойствам
эритроцитов, которые устанавливают с
помощью стандартных сывороток, содержащих
известные агглютинины.

1. На
   чистые чашки Петри в обозначенные
   участки наносят по 1 капле сыворотки
   I,
   II
   и III
   групп двух
   серий,
   содержащих соответственно агглютинины:
   I
   – 
   и ,
   II
   – 
   и III
   – .

2. В
   каждую каплю сыворотки с помощью
   стеклянных палочек или разных углов
   предметных стекол вносят небольшое
   количество донорской крови и тщательно
   размешивают кровь в капле сыворотки
   палочкой до тех пор, пока смесь не примет
   равномерного розового цвета.

3. Покачивают
   чашку Петри в течение 5 минут. При
   наличии агглютинации капля становится
   прозрачной, а эритроциты склеиваются
   в виде комочков.

4. По
   мере наступления агглютинации, но не
   раньше, чем через 3 минуты в каждую смесь
   добавляют по одной капле физиологического
   раствора для предупреждения образования
   «монетных столбиков» из эритроцитов.

5. Определяют
   наличие агглютинации в каждой капле и
   устанавливают группу крови.

• Отсутствие
  агглютинации во всех трех каплях
  говорит об отсутствии агглютиногенов
  А и В в эритроцитах исследуемой крови,
  такая кровь принадлежит O(I)
  группе.

• Если
  агглютинация произошла с сыворотками
  I
  и III
  групп, содержащих соответственно
  агглютинины 
  и ,
  то, следовательно, эритроциты исследуемой
  крови содержат агглютиноген А и эта
  кровь принадлежит А(II)
  группе.

• Если
  агглютинация произошла с сыворотками
  I
  и II
  групп, содержащих агглютинины 
  и ,
  то эритроциты исследуемой крови
  содержат агглютиноген В и эта кровь
  принадлежит В(III)
  группе.

• Наличие
  агглютинации в сыворотках всех трех
  групп указывает на присутствие в
  эритроцитах исследуемой крови
  агглютиногенов А и В, следовательно,
  она принадлежит АВ(IV)
  группе. Однако, в этом случае для
  исключения неспецифической агглютинации
  эритроцитов необходимо провести
  дополнительное исследование со
  стандартной сывороткой группы АВ (IV).
  Отсутствие агглютинации в этой капле
  позволит считать реакцию специфической
  и отнести исследуемую кровь к АВ(IV).

Источниками
ошибок могут быть:

1. Оценка
   реакции отрицательной
   при фактическом
   наличие агглютинации. Это может быть
   обусловлено:

   1. Поздней
      или слабовыраженной агглютинацией в
      связи с малой активностью стандартных
      сывороток;

   2. Нарушением
      соотношения 1:10 при взятии большого
      количества крови;

   3. Наличием
      температуры воздуха большей, чем 25оС.
      В таких случаях исследования проводят
      при охлаждении стекла.

2. Оценка
   реакции положительной
   при практическом отсутствии агглютинации.
   Это может быть обусловлено:

   1. Образованием
      «монетных столбиков»;

   2. Наличием
      панагглютинации, которая развивается
      при

t=15
оС; для ее
исключения следует повторить определение
при более высокой температуре;

1. 1. Подсыханием
      сывороток и образованием по краям
      капель «зернистости», принимаемой за
      агглютинацию. Это может быть в тех
      случаях, когда чтение результатов
      производится более чем через 5 минут.

Оформление
протокола. Записать
принцип метода определения группы
крови, ход работы. Зарисовать полученные
результаты: обозначить номер группы
крови, агглютинины стандартных сывороток
и отсутствие или наличие агглютинации,
например, —

группа
крови

неизвестная
кровь (эритроциты)

агглютинины
сывороток

Вывод.
Назвать и
правильно записать группу крови.
Обосновать полученный результат. Указать
в каких случаях исследуемая кровь может
быть использована в качестве донорской.
Нарисовать схему совместимости групп
крови системы АВО.

Определение ГК донора и реципиента

Вначале медицинский работник проводит определение ГК пациента по антигенам группы AB0. Самыми распространенными являются два метода – определение ГК при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и с использованием цоликлонов.

Методика проведения проб с использованием стандартных сывороток и планшеток

При использовании изогемагглютинирующих сывороток применяются стандартные сыворотки и специальные белые гладкие эмалированные тарелки со смачиваемой структурой, размеченные по 4 группам соответственно.

Порядок действий врача следующий:

1. Врач указывает на тарелке ФИО пациента.
2. Капает по 1 капле сывороток 0, А и В, причем используется 2 серии сывороток (получается 6 капель).
3. Берет кровь у реципиента (капиллярную или венозную).
4. Полученную каплю крови помещает в центр тарелки и смешивает отдельно с каждым образцом сыворотки (причем объем сыворотки нужно брать в 10 раз больше, чем объем капли крови).
5. Перемешивает каждую пару сыворотка-кровь отдельной палочкой. Агглютинация начинается через 10-30 сек.
6. В капли, где наблюдается агглютинация, добавляет по 1 капле физраствора и оценивает результаты.

Цоликлоны, использующиеся при определении групп крови

Также возможны постановки проб с цоликлонами (анти-А и анти-Б). Процедура определения ГК будет похожа на описанную выше.

Отсутствие агглютинации с цоликлоном будет также означать отсутствие однобуквенного агглютинина на эритроците. Так, кровь III группы будет давать агглютинацию только с анти-В цоликлоном.

При проверке резус-фактора в медицине применяется так называемый ускоренный метод со стандартным универсальным реагентом .

Для этого в цетрифужную пробирку объемом не более 10 мл капают 1 каплю реагента (универсальной антирезусной сыворотки четвертой группы, с 33% декстраном — полимерным углеводом) и капают туда 1 каплю крови пациента. Затем круговым движением смешивают и разносят смесь по стенкам пробирки, затем ждут 3 минуты. На следующем этапе добавляют в емкость 2-3 мл физраствора и переворачивают емкость 2-3 раза, избегая взбалтывания. При наличии видимых лепестков агглютинации делают вывод о том, что резус-фактор положительный.

Кровь донора обязательно маркируется

Группа крови донора обычно определяется заранее, и на пакете с кровью должна быть нанесена соответствующая маркировка. Так, II группа обозначается синим, III – красным, а IV имеет желтую полоску.

Перед переливанием нужно визуально оценить ее качество: кровь, подходящая для переливания сверху желтоватая (слой плазмы), а внизу — темно – красная, собственно осадок из эритроцитов.

Однако, если в пакете видны сгустки, хлопья или пленки, а так же если плазма розовая (признак гемолиза), то такую кровь нельзя использовать.

Контрольное установление группы крови донора проводят после полного размораживания пакета. Каплю для анализа берут не из основного, а из маленького дополнительного отсека пакета. Методика определения аналогична таковым при определении у реципиента.

Результаты контрольного определения должны совпасть с информацией на флаконе. После успешного контрольного определения, приступают к выполнению проб на совместимость.

ПОНЯТИЕ О ТИТРЕ

Реакция агглютинации с различными сыворотками и эритроцитами может в одних случаях наступить довольно быстро и быть четко выражена, в других она менее выражена и возникает более медленно. Иногда агглютинация и при большом разведении сыворотки четко выявляется, в других случаях даже слабое разведение приводит к не проявлению её. Все это обусловлено тем, что чувствительность эритроцитов и сыворотки подвержена значительным колебаниям. Под титром агглютинации понимается максимальное разведение сыворотки, при котором еще может наступать реакция агглютинации. При определении титра сыворотки, постоянной величиной являются стандартные эритроциты; при определении титра эритроцитов, постоянной величиной является стандартная сыворотка. Титр понятие относительное, так как титр эритроцитов точно устанавливается только по отношению к испытуемой сыворотке, а титр сыворотки только к испытуемым эритроцитам. К другим эритроцитам он может быть другой, но колебания его обычно бывают небольшими. Однако целый ряд эритроцитов обладает одинаковой чувствительностью, также как и ряд сывороток имеет одинаковый титр. Титр зависит и от метода определения. При определении капельным методом на тарелке у здоровых людей титр сыворотки колеблется в пределах 1:8-1:32. Если титр определяется в пробирках, он получается значительно выше.

Практическое значение имеет тот факт, что титр агглютининов новорожденных крайне низкий, а по мере развития человека он повышается; достигая максимума в возрасте от 5 до 20 лет, дальше он начинает падать. Титр агглютиногенов может меняться при заболеваниях. Повышение его отмечается при ряде воспалительных процессов, резкое снижение бывает при тяжелой общей инфекции. Слабый титр сыворотки отмечен при лейкемии. У здоровых же людей титр сыворотки остается почти неизменным.
ЗАВИСИМОСТЬ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ОТ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ

Температура. Химические факторы. котором находятся эритроцитыФеномен Томсена. течение суток при комнатнойПанагглютинация (аутоагглютинация)то же время дают агглютинацию соПсевдоагглютинация.монетные столбики независимо от ихОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ ПО СТАНДАРТНЫМ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИМ СЫВОРОТКАМ (ПРОСТОЙ МЕТОД)исследуемой крови групповыхМатериальное оснащениеМетодика выполнения:

Определение группы крови производится при температуре не ниже +15 С и не выше +25 С.

Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

Осмотреть стандартные гемагглютинирующие сыворотки, чтобы они не содержали осадка, не был просрочен срок годности, были правильно расположены по отношению друг к другу.

На пластинке (тарелке) написать фамилию больного.

Согласно обозначениям групп крови на тарелке, в каждую лунку нанести отдельной пипеткой по одной капле стандартной сыворотки — первой, второй и третьей группы двух серий образуя два ряда по три капли в каждом.

Взять кровь. Кровь для исследования берется из пальца или вены. При взятии крови из пальца в левую руку взять левую кисть больного, обработать спиртом дистальную фалангу IV пальца и проколоть стерильной иглой, при этом первую каплю крови удалить.

Шесть капель крови перенести стеклянной палочкой на терелку, размещая их рядом с каплей стандартной сыворотки. Можно на тарелку нанести одну большую каплю крови, а затем уголком предметного стекла перенести в капли сыворотки. Каждый раз кровь берут новым уголком стекла. Соотношение исследуемой крови и стандартной сыворотки должно быть 1:10.

Место укола пальца обработать спиртом

Каждую каплю крови и сыворотки на пластинке смешать отдельной палочкой
Пластинку осторожно покачивать в течение 5 минут, постоянно обращая внимание на лунки, где может наступить аггютинация (склеивание эритроцитов). По мере наступления агглютинации, но не раньше чем через три минуты в капли на пластинке (тарелке) добавить по одной капле изотонического раствора хлорида натрия

Реакция агглютинации может быть положительной или отрицательной

капле появляются мелкие красныекрасный цвет₂

Результаты исследования в одной и той же группе двух серий должны совпадать.

Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки

Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки, используемые для определения группы крови, соответствуют четырем группам крови 0 (I), А (I I), В (I I I), AB (IV). Их получают из крови, реже из других жидкостей (асцитической, плеврального экссудата). Используется кровь от доноров, трупная или плацентарная кровь. Кровь отстаивается и забирается сыворотка, к которой добавляется консервант (борная кислота из расчета 3,0 г порошка на 100 мл сыворотки). После отстаивания сыворотка разливается по стерильным ампулам или флаконам, которые сразу же запаиваются или герметично закупориваются.

Требования, предъявляемые к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам:

1. агглютинация с соответствующими эритроцитами должна появиться в течение 15-20 с, а через 2 мин. она должна быть четкой;
2. не давать агглютинацию с эритроцитами одноименной и первой групп;
3. титр сыворотки должен быть не ниже 1 : 32;
4. сыворотка должна быть без признаков микробного загрязнения, прозрачной;
5. каждая ампула должна иметь паспорт с обозначением группы, срока годности, титра, места и времени приготовления, нанесены соответствующего цвета полосы.

холодильнике

Проба на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по резус-фактору Rho(d)

Эта
проба дает возможность выяснить наличие
или отсутствие антител системы резус
в крови реципиента, направленных против
эритроцитов донора. В пробирку помещают
2 капли сыворотки крови реципиента, 1
каплю 33% полиглюкина и 1 каплю донорской
крови. в нее в 10 раз меньшую каплю крови
донора. Содержимое пробирки перемешивают
путем размазывания его по ее стенкам.
Через 3 минуты в пробирку добавляют 3 мл
физиологического раствора хлорида
натрия и после перемешивания читают
результат. При положительном результате
видна агглютинация эритроцитов,
выраженная в большинстве случаев неярко.
При отрицательном результате агглютинация
не наступает и содержимое остается
равномерно окрашенной в розовый цвет.
Положительный результат указывает на
то, что в сыворотке реципиента содержатся
антитела, вызывающие агглютинацию
эритроцитов донора. Это значит, что
кровь несовместима и ее переливать
нельзя. Отрицательный результат —
отсутствие агглютинации указывает и
на то, что противопоказаний к переливанию
данной пробой не выявлено. Постановка
пробы на резус-совместимость может в
отдельных случаях сопровождаться
возникновением ложной реакции —
псевдоагглютинации донорских эритроцитов
в сыворотке реципиента. Дифференцировать
истинную и псевдоагглютинацию можно
только при рассмотрении под микроскопом
свежеприготовленного мазка. Результат
учитывается при малом увеличении
микроскопа с окуляром .(х15). Истинная
агглютинация дает глыбки агглютинатов
в виде «тутовых ягод» или «гроздей
винограда». При ложном положительном
результате на фоне свободных эритроцитов
видны разной длины цепочки эритроцитов,
сложившихся в монетные столбики.

Следует
помнить: проба на резус-совместимость
не заменяет пробы групповой совместимости
и ограничиваться ее проведением нельзя.
Практика показывает, что в ряде случаев
проба на резус-совместимость бывает
отрицательной, в то время как на групповую
совместимость дает четко положительный
результат, что указывает на недопустимость
переливания крови этого донора.