Методы определения содержания гемоглобина в крови

Что такое талассемия?

Талассемия — это группа наследственных факторов, влияющих на количество гемоглобина. Неспособность организма вырабатывать необходимое количество молекул глобулина приводит к тому, что организм начинает компенсировать недостачу другими менее совместимыми молекулами глобулина. Различные виды талассемии определяются по типу недостающей молекулы глобулина. Серьезность этого заболевания зависит от типа недостающей глобулиновой цепи, количества дефицитных глобулинов и степени дефицита. В легкой форме это заболевание проявляется в виде легкой анемии, тогда как более тяжелое течение заболевания может быть несовместимо с жизнью.

Методика и техника выявления

Выраженная Г. может быть определена визуально по интенсивности красной окраски плазмы исследуемой крови. Количественное определение свободного гемоглобина плазмы проводят на фотоколориметре по Бингу в модификации Г. В. Дервиза и Н. К. Бялко (1966). Методика позволяет выявить даже незначительный гемолиз.

Метод основан на выявлении пероксидазных свойств гемоглобина с помощью бензидиновой реакции. Реактивы: ацетатный буфер, перекись водорода и солянокислый бензидин. Кровь для анализа берут из вены сухой иглой и обязательно в силиконированную пробирку с антикоагулянтом. Центрифугируют не более 10 мин. при 1500 об/мин (чтобы не повредить эритроциты). Плазму (после отделения) вновь центрифугируют 10 мин. при 8000 об/мин. В пробирку наливают ацетатный буфер, перекись водорода, раствор бензидина и испытуемую плазму. Смешивают и оставляют стоять на 3 мин. Одновременно готовят контрольный раствор. Фотометрируют при красном светофильтре. Интенсивность голубой окраски нарастает в течение 4—5 мин., поэтому .величину оптической плотности измеряют 3—5 раз и регистрируют максимальные показания. Через 5—6 мин. окраска приобретает лилово-буроватый оттенок и оптическая плотность начинает уменьшаться. Результат берут средний из определения оптической плотности двух параллельных проб.

Количество растворенного гемоглобина в миллиграмм-процентах определяют на калибровочной кривой по оптической плотности.

6) Определение группы крови (Учебное пособие «Физиология крови», стр.57)

Ход
работы:
на специальные тарелки наносят (не
смешивая!) по капле стандартной сыворотки
1, 2 и 3 групп, содержащей соответственно

агглютинины
1 — альфа и бета; 2 — бета и 3 — альфа. Углом
предметного стекла переносят небольшое
количество крови, полученной из пальца,
в каплю сыворотки 1 группы, затем вторым
чистым углом предметного стекла такое
же количество крови переносят в сыворотку
2 группы. Третью каплю переносят в
сыворотку 3 группы третьим углом
предметного стекла. Каждый раз тщательно
размешивают кровь в капле сыворотки,
пока смесь не станет равномерно розового
цвета. Реакция агглютинации наступает
через 1 — 5 мин. При наличии агглютинации
капля становится прозрачной, а эритроциты
склеиваются в виде комочков. Группа
крови устанавливается в зависимости
от наличия или отсутствия агглютинации.
Зарисуйте схематично результаты опыта,
а в выводах определите, каким реципиентам
может быть перелита исследуемая кровь
и какие современные требования к
гемотрансфузии крови в зависимости от
Фуппы крови донора и реципиента.

Суть гемихромного метода определения гемоглобина

Гемоглобин имеет множество различных форм. Для упрощения подсчета его количества пигмент переводят в одну форму – гемихром (HbChr). Он имеет интенсивный красный цвет и длину волны 540 нм, поэтому подсчитывается легко. Его число отображает всю концентрацию Hb в исследуемой жидкости.

Для перевода гемоглобина в гемихром использует реагенты для трансформации:

• четвертичные аммониевые основания с ПАВ;
• соли жирных кислот с добавлением ЭДТА;
• SDS.

Выпускаются новые реагенты, в составе которых отсутствуют цианиды. Они основаны на додецилсульфате натрия.  Наилучшим веществом является SDS. Скорость перехода пигмента при его использовании намного выше, чем у других реактивов. Необходимо всего 5 минут. С помощью реагентов возможно использование исследования в качестве экспресс-метода. То есть возможно проведение множества анализов за 1 рабочий день. При этом пациент получает на руки готовый результат в день сдачи биологической жидкости.

В лабораториях часто используют исследования гемоглобина гемихромным методом с помощью реактивов Ольвекс. Он содержит натрия лаурилсульфат, полностью безопасный для врачей. Его достоинством является низкая стоимость при высоком качестве и продолжительном сроке годности.

Материалом для исследования является капиллярная или венозная кровь. Последний вариант используется чаще, так как исследование более достоверно. Узнайте, чем отличается анализ крови из пальца и вены.

В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, например, ЭДТА или гепарин. Это предотвратит образование сгустка.

Исследование проводят в несколько этапов.

• В биологическую жидкость добавляют трансформирующий раствор в соотношении 20:5000 мкл. Полученный образец тщательно перемешивают. Возможно использование центрифуги. Жидкость должна тщательно перемешаться. Реагент воздействует на кровь в течение 5 минут.
• Для определения концентрации гемоглобина используют фотометр. Это оптический прибор, который подсчитывает показатель при длине волны 540 нанометров.
• Результат, полученный с помощью полуавтоматического анализатора, подставляют в формулу C =A×f, где C – концентрация гемоглобина; A – данные, полученные на фотометре; f – фактор, индивидуальный для каждого фотометра.

Полученные данные записывают на бланке исследования, передают пациенту. Он может самостоятельно сравнить результат с нормой. Но для постановки диагноза необходимо обратиться к врачу. Он выявит отклонения, назначит лечение.

На бланке исследования записывается полученные результаты, которые можно сравнить с нормой. Она разнится по возрасту и полу. Данные описаны в таблице.

Незначительное отклонение показателя не свидетельствует о появлении заболевания. Отклонение от нормы в меньшую или большую степень на несколько единиц должно быть проверено повторным исследованием. Если результат тот же, врач должен выявить причину состоянии, назначить лечение.

Как измеряют уровень гемоглобина?

Уровень гемоглобина обычно измеряется после забора образца крови для общего анализа.

Существует несколько вариантов измерения гемоглобина, большинство из которых в настоящее время выполняются автоматическими машинами, предназначенными для проведения различных анализов крови. Внутри таких автоматических приборов красные кровяные клетки разделяются, чтобы выделить молекулы гемоглобина в специальный раствор. Свободный гемоглобин подвергается воздействию химического вещества, содержащего цианид, который связывается с молекулой гемоглобина с образованием цианметгемоглобина. Далее раствор просвечивают светом и измеряют, сколько света поглощается (особенно на длине волны в 540 нанометров), таким образом определяется количество гемоглобина.

Когда необходимо сдать анализ на гемоглобин

В современной медицинской практике анализ крови на гемоглобин считается базовым. Исследование назначается при постановке беременных на учет, для уточнения диагноза при подозрении на малокровие или развитие других патологий. Жизнь в условиях ухудшающейся экологии, постоянные психические и физические перегрузки требуют внимательного отношения к своему здоровью. Хроническая усталость, частые депрессии, потеря интереса к жизни – серьезный повод для визита к врачу и получения направления на прохождение исследования крови.

Показаниями к назначению анализа на гемоглобин являются:

• частые головные боли;
• появление сухости во рту;
• вялость, сонливость или мучительная бессонница;
• побледнение кожных покровов, длительно не сходящие синяки;
• сильная жажда и участившиеся позывы к мочеиспусканию;
• ухудшение зрения и памяти;
• плохая заживляемость порезов и ран;
• нестабильность психоэмоционального состояния.

Уточнение показателя уровня гемобелка в крови особенно важно для беременных женщин, вынашивающих ребенка, родителей, планирующих пополнение в семье, больных стойкой гипергликемией. Сам анализ крови на гемоглобин проблемы не устраняет, но может подтолкнуть к кардинальным изменениям образа жизни

Отказ от вредных привычек, сбалансированное питание и полноценный отдых способны уберечь от необратимых изменений в эндокринной системе. Чтобы улучшить качество жизни, спокойно встречать каждый новый день, достаточно периодически выделять несколько минут, чтобы сдать биоматериал на исследование

Сам анализ крови на гемоглобин проблемы не устраняет, но может подтолкнуть к кардинальным изменениям образа жизни. Отказ от вредных привычек, сбалансированное питание и полноценный отдых способны уберечь от необратимых изменений в эндокринной системе. Чтобы улучшить качество жизни, спокойно встречать каждый новый день, достаточно периодически выделять несколько минут, чтобы сдать биоматериал на исследование.

Минусы гемиглобинцианидного метода определения гемоглобина

Использование цианидных реактивов в лабораторной диагностике устарела. Это вызвано тем, что исследование имеет следующие отрицательные стороны:

• возможность поражения кожных покровов и дыхательных путей врача-лаборанта реактивами;
• наличие более современных методов, которые более безопасны для лаборанта;
• возможность врачебной ошибки в неправильной подборке дозировки реактивов;
• прибор не выдает данные по определению формы или размеров клеток, поэтому для их выявления требуется проведение дополнительных анализов.

Так как цианидные соединения являются вредными для человека, разработан гемихромнй метод. Он полностью безопасен и на данный момент вытесняет гемиглобинцианидную методику из клинической лабораторной диагностики.

4)Что выражает цветовой показатель, как он определяется (приведите пример расчета).

Цветовой
показатель: отношение количества
гемоглобина крови (относительное
содержание) к числу эритроцитов
(относительное содержание). Этот
показатель позволяет оценить степень
насыщения эритроцитов гемоглобином. В
норме цветовой показатель составляет
0,8-1,0

ЦП= Hb% / Эр%
(формула 1)

Для расчета
относительного содержания эритроцитов
(Эр%) за 100% принимаем количество эритроцитов
5*1012 Показатель А (формула 2)- количество
эритроцитов исследуемой крови

Пропорция
5*1012 – 100% отсюда А*100

А — Эр% Эр%=
—————

5*1012

Подставляя
значение Эр% в формулу расчета цветового
показателя (формула 1) находим ЦП.

5)Что такое
кислородная емкость крови, как она
определяется? Что такое оксигемоглобин,
карбгемоглобин, карбоксигемоглобин,
метгемоглобин?

Кислородная
емкость крови (КЕК) — это количество
кислорода, которое может быть связано
гемоглобином после полного насыщения
его кислородом. Может быть определен
экспериментально, менее точен расчет
по формуле (на 100 мл крови):

КЕК (мл О2
/100 мл крови) = а х содерж. НЬ в 100 мл крови,
где а — константа Гюфнера, равная 1,36 мл
О2 /1 г НЬ. При содержании НЬ = 15 г/100 мл
крови:

КЕК = 1,36 • 15
= 20,4 мл О2/100 мл крови.

Нормальные
величины КЕК для человека — 18—21 мл
02 /100 мл крови.

Оксигемоглобин:
соединение гемоглобина с кислородом

Карбгемоглобин:
соединение гемоглобина с углекислым
газом

Карбоксигемоглобин:
соединение гемоглобина с угарным газом

Метгемоглобин
– окисленный гемоглобин, в котором
железо находится в форме 3+

Практическая работа №3. Вычисление цветового показателя и содержания гемоглобина в одном эритроците.

Цель работы:Знакомство со способом
вычисления ЦП и СГЭ.

Методика:1. Цветовой показатель
выражает среднее содержание гемоглобина
в 1 эритроците. В норме цветовой показатель
равняется 0,85-1,05. Рассчитывают его по
следующей формуле:

[(найденное количество Нв)/(нормальное
количество Нв)]

ЦП =
—————————————————————————————

[(найденное число эритроцитов)/(нормальное
число эритроцитов)]

При преобразовании приведенной выше
формулы получают следующий вывод:
найденное количество гемоглобина
умножают на 3 и делят на первые три цифры
подсчитанных эритроцитов.

Определив в крови обследуемого количество
гемоглобина и число эритроцитов,
вычислить по указанной выше формуле
цветовой показатель.

1. В последнее время наряду с цветовым
   показателем рассчитывают более
   достоверную величину — содержание
   гемоглобина в одном эритроците.

Hbв г/л

СГЭ = —————————= пг

число эритроцитов 1012

(1 пикограмм = 1-12г)

1. Определить цветовой показатель и СГЭ
   без расчета можно с помощью номограммы.
   Для этого достаточно соединить линейкой
   значение найденного количества
   гемоглобина и подсчитанных эритроцитов.

Оформить результаты работы и выводы.

4) Подсчет количества эритроцитов

Ц
е л ь р а б о т ы: освоить методику и
определить количество эритроцитов в
исследуемой крови.

Д
л я р а б о т ы н е о б х о д и м ы: микроскоп,
счетная камера Горяева, меланжер для
эритроцитов, 3 % раствор хлорида натрия,
покровные стекла, регулируемая пипетка,
пробирки, стерильный скарификатор,
вата, спирт, эфир, йод. Объект исследования
— человек.

Х
о д р а б о т ы

Необходимо
перед началом работы рассмотреть
счетную камеру под микроскопом, найти
малые квадратики и большие квадраты
сетки (рис.1). Камеру предварительно
необходимо подготовить путем притирания
покровного стеклышка к боковым
выступающим граням камеры до появления
цветных (ньютоновских) колец. В каплю
свежей крови, полученной из пальца,
погрузить кончик меланжера (с красной
бусинкой в расширении) для эритроцитов
и набрать кровь до метки 0,5, следя, чтобы
в капилляр не

попали
пузырьки воздуха. Быстро, пока кровь
не свернулась, перенести кончик меланжера
в 3 % раствор хлорида натрия и набрать
его до метки 101, т.е. развести кровь в
200 раз. После этого взять заполненный
меланжер (смеситель), зажать его концы
1 и 3 пальцами и в течение 1 мин встряхи-

вать.
После тщательного перемешивания крови,
удалив предварительно 1-2 капли, нанести
небольшую капельку на сетку камеры.

При
необходимости такое же разведение
может быть выполнено другим способом.
Например, 0,02 мл крови смешать с 4 мл 3 %
NaCl в пробирке. Содержимое пробирки в
этом случае тщательно перемешивается.

Если
капля разведенной крови будет слишком
велика, то жидкость может попасть на
боковые грани камеры и высота слоя над
сеткой будет больше 0,1 мм. В этом случае
камеру следует промыть дистиллированной
водой, насухо вытереть и заполнить
снова. Разведенную (в меланжере) кровь
следует еще раз перемешать.

Заполнив
камеру, поместить ее под микроскоп и,
если форменные элементы расположены
равномерно (что является показателем
хорошего перемешивания крови), приступить
к подсчету. Считать эритроциты удобнее
при большом увеличении.

Необходимо
подсчитать число эритроцитов в 5 больших
квадратах, расположенных в разных
местах сетки, например, по диагонали.
Во избежание двухкратного подсчета
клеток, лежащих на границе между малыми
квадратиками, руководствоваться
правилом Егорова, согласно которому,
относящимися к данному квадратику
считаются эритроциты, лежащие как
внутри квадратика, так и на его левой
и верхней границе. Эритроциты, лежащие
на правой и нижней границе для данного
квадратика не учитываются.

Формула
для вычисления количества эритроцитов
в 1 мм3
крови:

А
х 4000 х 200

N
= ————————,
где:

80

N
— искомое число эритроцитов;

А
— число эритроцитов в 80 маленьких
квадратиках (или в 5 больших);

4000
— множитель для получения содержания
эритроцитов в одном мм3
крови;

200
— степень разведения эритроцитов.

Для
перевода полученного количества
эритроцитов в единицы СИ, подсчитанное
количество эритроцитов умножить на
106
и выразить в N х 1012
/л (тера на литр). Зарисовать фрагмент
сетки камеры Горяева с маленькими и
большими квадратами.

В
выводе сравнить количество подсчитанных
эритроцитов с нормой.

Суть гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Гемоглобин имеет множество различных форм. Все их пересчитать невозможно. Поэтому используют гемиглобинцианидный метод, который дает возможность определить одну форму – гемиглобинцианид (HbCN). Клетки трансформируется, так как на них воздействуют реактивы:

• феррицианид калия – переводит гемоглобин в метгемоглобин;
• цианид калия – образует гемиглобинцианид, который имеет красное окрашивание;
• дигидрофосфат калия – вещество, с помощью которого реакция ускоряется
• не ионный детергент – разрушает эритроциты, исключает помутнение раствора, вызванное выделением белков.

Если в лаборатории нет феррицианида калия, гемиглобинцианидный методпроводят с применением ацетонциангидрита, который также образует метгемоглобин. На его основе создан набор реагентов – гемоглобин-АГАТ. Гемиглобинцианидный методс калибратором рассчитан на 600 определений при расходе 5 л рабочего раствора за 1 анализ. Стоимость такого набора не высока, поэтому часто он применяется в клинической лабораторной диагностике.

Методика одобрена Комитетом стандартизации. Поэтому исследование является унифицированным, то есть общепринятым во всех лабораториях. Для анализа необходимо получение капиллярной и венозной крови. В последнем случае результат будет более достоверным. В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, который предотвращает образование сгустков.

Далее ход проведения исследования делится на несколько этапов.

• Проводят разведение в соотношении 20 микролитров крови на 5 мл реактива. Полученную жидкость перемешивают. Возможно использование центрифуги. Пробирку отстаивают в течение 10 минут.
• Для исследования жидкости используют фотометр. Он определяет клетки на длине волны 543 нм. В этих пределах измеряется гемиглобинцианид.
• Дополнительно в прибор устанавливают стандартный раствор, с которым сравнивается полученный результат. Это необходимо для калибровки величины.
• Полученные данные подставлять в калибровочный график. Для упрощения можно определять концентрацию гемоглобина гемиглобинцианидным методом без калибра. В этом случае используют формулу.

Формула для определения количества гемоглобина:

Hb= Eопт/Eст×C×K×0,001×10

• Eопт – экстинкция (проницаемость) опытного образца;
• Eст – экстинкция стандартного образца;
• С – количество гемиглобинцианида в стандартном образце;
• К – коэффициент разведения биологической жидкости;
• 0,001 – число, необходимое для пересчета миллиграммов в граммы;
• 10 – число для пересчета г% в г/л.

После получения данных возможно их сравнение с нормой. Это может осуществлять пациент, но для постановки точного диагноза и проведения лечения необходимо проконсультироваться с лечащим врачом.

Незначительное отклонение показателя от нормы не говорит о наличии какого-либо заболевания. В этом случае проводят повторное тестирование. Если показатель отклоняется на несколько единицы в нижнюю или верхнюю сторону, врач должен провести дополнительные тестирования, назначить лечение.

Данные по нормальному количеству гемоглобина в исследуемой жидкости записаны в таблице. Число показателя меняется с возрастом, зависит от пола.