Нагрузочные пробы с глюкозой

Венозная кровь

Кровь собирают в пробирки с фторидом натрия, предотвращающим гликолиз, из-за которого уро­вень глюкозы может оказаться заниженным. В от­сутствие таких пробирок пробы крови сразу же (не позднее 30 минут) центрифугируют, и плазму или сыворотку хранят при 4°С.

В лабораториях содержание глюкозы в плазме обычно определяют ферментативными (глюкозо- оксидазным или гексокиназным), колориметриче­скими (а-толуидиновым) или автоматическими методами. Последние основаны на восстановлении соединений меди или железа сахарами сыворотки после ее диализа. При всем удобстве автоматиче­ских методов они не специфичны для глюкозы, так как реагенты взаимодействуют и с другими восста­навливающими веществами (содержание которых повышено при азотемии и при высоком потребле­нии аскорбиновой кислоты).

Капиллярная кровь

Измерения глюкозы в капиллярной крови, про­изводимые самим больным в домашних условиях, имеют важнейшее значение. У больных сахарным диабетом 1 типа, пытающихся осуществлять жест­кий контроль гликемии, такие измерения совер­шенно обязательны. Содержание глюкозы в капил­лярной крови определяют с помощью тест-полосок (пропитанных глюкозооксидазой, глюкозодегид- рогеназой или гексокиназой), помещая их в глюко­метр или амперметр. В настоящее время выпуска­ется множество таких приборов. Все они достаточ­но точны, но различаются скоростью работы, необходимым объемом крови и ценой. Лучшие из них требуют всего 0,3 мл крови и выдают резуль­тат меньше чем через 7 секунд. Более дорогие моде­ли снабжены компьютером, вычисляющим сред­ние показатели, и, будучи присоединенными к принтеру, записывают показания в цифровой или графической форме. Для прокола пальца использу­ют специальный ланцет — иглу 28-30 калибра (во врачебных кабинетах и больницах пользуются сменными иглами). Существуют и модели для оп­ределения уровня глюкозы в пробах крови, взятых не из пальца, а из других мест (предплечье, бедро). Однако быстро развивающаяся гипогликемия регистрируется в крови из предплечья на 5-20 минут позднее, чем в крови из пальца.

Клиницист должен знать о возможных погреш­ностях измерения глюкозы при самоконтроле. Во-первых, ряд старых глюкометров калиброваны по уровням глюкозы в цельной крови, а тест-полос- ки реагируют на глюкозу в плазме. Поэтому показа­ния таких приборов следует увеличить на 10-15%. Во-вторых, увеличение или снижение гематокрита соответственно снижает или повышает результаты измерений. По-видимому, эритроциты препятству­ют диффузии плазмы в слой реагентов. В-третьих, глюкометры и тест-полоски рассчитаны на колеба­ния концентрации глюкозы в пределах 60-160 мг%, и при больших или меньших ее концентрациях точ­ность измерений может снижаться на целых 20%. В-четвертых, при высоком напряжении кислорода в крови амперометрические системы, основанные на глюкозооксидазном методе, занижают концен­трацию глюкозы, и если больной дышит кислоро­дом, лучше использовать системы, основанные на глюкозодегидрогеназном методе. Самоконтроль требует обучения больных приемам отбора проб крови и правилам измерения, а также точной калиб­ровки используемых приборов. В клиниках необхо­димы строгий контроль качества анализов и квалификации персонала лабораторий.

Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по н.В.Климкиной и с.И.Плитману

Реактивы.
Диазотированный n-нитроанилин (готовят
перед употреблением из 0,1%-ного раствора
n-нитроанилина в 0,1 М соляной кислоте,
добавляют к 10 мл охлажденного на льду
раствора n-нитроанилина 1 мл 4%-ного
раствора нитрита натрия); гистамин,
стандартный раствор концентрации 200
мкмоль/л; карбонат натрия, 20%-ный раствор;
гидроксид натрия, 5 М раствор; трихлоруксусная
кислота, 10%-ный раствор; универсальная
индикаторная бумага.

Оборудование.
Штатив с пробирками; воронка с бумажным
фильтром; стеклянные палочки; водяная
баня; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; ФЭК.

Материал.
Цельная кровь крысы или кролика,
осажденная 10%-ным раствором трихлоруксусной
кислоты в отношении 1:9 для экстракции
гистамина (выдерживается в холодильнике
в течение суток).

Метод
основан на взаимодействии между
гистамином и диазотированным
n-нитроанилином с образованием соединения
оранжево-красного цвета.

Ход
определения.
Трихлоруксусный экстракт крови фильтруют
через бумажный фильтр. В одну пробирку
отмеривают 2 мл фильтрата (опыт), в другую
– 0,2 мл стандартного раствора гистамина
и 1,8 мл дистиллированной воды (стандарт).
В обе пробы прибавляют по 3 мл
дистиллированной воды и 1 мл раствора
нитрита натрия. Пробирки тщательно
встряхивают и ставят на 2 мин в кипящую
водяную баню.

Затем
пробирки охлаждают под струей водопроводной
воды и к охлажденным пробам добавляют
по 1 мл диазотированного n-нитроанилина.
Тщательно перемешивают пробы и доводят
их рН до 10,0 по универсальной индикаторной
бумаге, прибавляя сначала 1,5 мл, а затем
0,5 мл раствора карбоната натрия. Содержимое
пробирок перемешивают, охлаждают под
струей водопроводной воды и прибавляют
2-3 капли раствора гидроксида натрия до
развития окрашивания.

Экстинкцию
опытной и стандартной проб измеряют на
ФЭКе при 520-540 нм (зеленый светофильтр)
в кювете с толщиной слоя 0,5 см против
контроля на реактивы (10 мл дистиллированной
воды, по 2 мл растворов нитрита натрия
и диазотированного n-нитроанилина, 4 мл
раствора карбоната натрия перемешивают
и приливают 0,6 мл раствора гидроксида
натрия).

Расчет
проводят по формуле

Е_оп200

х
= ————— ,

Е_ст

где
х – концентрация гистамина в цельной
крови, мкмоль/л;

Е_оп
– экстинкция опытного раствора;

Е_ст
– экстинкция стандартного раствора;

200
– концентрация стандартного раствора
гистамина, мкмоль/л.

Оформление
работы.
Рассчитать содержание гистамина в крови
и сделать вывод о возможных причинах
изменения его уровня. В выводе отразить
практическое значение определения
гистамина в крови.

Практическое
значение работы.
Гистамин относится к биогенным аминам.
Он играет роль тканевого регулятора и
медиатора в нервной системе. Гистамин
усиливает проницаемость стенок
кровеносных сосудов, стимулирует функцию
желез желудка (выработку соляной
кислоты), сократительную деятельность
матки и т.д. Избыточное содержание
гистамина в организме ведет к вегетативным
нарушениям и аллергическим реакциям.
Определение гистамина в практике
используется для исследования уровня
его в крови и тканях животных при действии
на них аллергенных веществ. Содержание
гистамина в крови имеет видовые колебания.
В крови лабораторных животных (крысы,
кролики) его концентрация составляет
90-220 мкмоль/л, а у здорового человека его
содержится 0,02-0,04 мкмоль/л.

В контрольно-аналитических
лабораториях этот метод применяется
для контроля качества заводских
препаратов гистамина в ампулах,
выпускаемых в виде 0,1%-ного раствора.

Методы определения глюкозы в крови

Для диагностики целого ряда заболеваний (к числу которых прежде всего следует отнести сахарный диабет, патологические состояния, связанные с недостаточностью функции печени и почек, некоторые эндокринные заболевания, новообразования мозга, поджелудочной железы и надпочечников, гиповитаминоз В1, а также ряд наследственных аферментозов) важно иметь объективное представление о состоянии углеводного обмена, кардиальным показателем которого служит содержание глюкозы в крови. Концентрация глюкозы в крови взрослого человека составляет в единицах СИ — 60-100 мг%, в международных единицах — 3,3 — 5,5 ммоль/л

В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом: 1. Редуктометрические. Практически не используются в клинике. 2. Колориметрические. Практически не используются в клинике. 3. Ферментативные:

— фотометрический по конечной точке — фотометрический кинетический — отражательная фотометрия — сухая химия — электрохимический;

— фотометрический по конечной точке — фотометрический кинетический

Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому опишем только принципы метода лабораторной диагностики, недостатки и преимущества метода.

Уметь

• объяснять
  значения терминов: гипергликемия,
  гипогликемия, глюкозурия, гликолиз,
  глюконеогенез, лактатацидоз.

• характеризовать углеводы как
  источник лекарственных препаратов.

3.
Знать химизм:
процессов гликолиза, аэробный
распад глюкозы, «обходных
реакций» глюконеогенеза

Ориентировочная основа действия
(ООД) для проведения самостоятельной
деятельности студентов (СДС) в учебное
время — изучение программного
материала «Обмен и функции углеводов:количественное определение глюкозы
(в крови и моче) глюкозооксидазным
методом

Основные углеводы животных, их содержание
в тканях, биологическая роль. Основные
углеводы пищи. Переваривание углеводов.

Глюкоза как важнейший метаболит
углеводного обмена: общая схема источников
и путей расходования глюкозы в организме.

Катаболизм глюкозы. Аэробный распад —
основной путь катаболизма глюкозы у
человека и других аэробных организмов.
Последовательность реакций до образования
пирувата (аэробный гликолиз) как
специфический для глюкозы путь
катаболизма. Рас­пространение и
физиологическое значение аэробного
распада глю­козы. Использование
глюкозы для синтеза жиров в печени и в
жи­ровой ткани.

Анаэробный распад глюкозы (анаэробный
гликолиз). Гликолитическая оксидоредукция,
пируват как акцептор водорода; суб­стратное
фосфорилирование. Распределение и
физиологическое значение анаэробного
распада глюкозы.

Биосинтез глюкозы (глюконеогенез) из
аминокислот, гли­церина и молочной
кислоты. Взаимосвязь гликолиза в мышцах
и глюконеогенеза в печени (цикл Кори).
Аллостерические меха­низмы регуляции
аэробного и анаэробного путей распада
глюкозы и глюконеогенеза.

Биотин. Метаболические функции и
проявления авитами­ноза.

Ориентировочная основа деятельности
студентов (ООД) для проведения лабораторной
работы:

Количественное определение холестерина в сыворотке крови

Уровни нормы
холестерола (ХС), выявленные при
обследовании «в целом здорового
населения» относительно высоки. С точки
зрения риска развития ИБС, выделяют
три уровня:

• рекомендуемый
  — менее 5,00 ммоль/л;

• умеренный
  риск — 5,00 – 6,20 ммоль/л;

• высокий риск —
  более 6,20 ммоль/л.

Увеличение
концентрации ХС наблюдается при различных
наследственных гиперлипопротеинемиях,
приобретённой гиперлипопротеинемии,
заболеваниях печени, холестазе, ИБС,
диабете, алкоголизме, гипотирозе,
гиперкортицизме, желчнокаменной болезни,
атеросклерозе, гипертонической болезни
и некоторых других патологических
состояниях. Гипохолестеролемия обнаружена
при гиполипопротеинемиях, некрозе
печёночных клеток, злокачественных
опухолях печени, гипертиреозе, нарушении
питания и т.д. Отмечены сезонные колебания
уровня ХС: более высокие показатели
осенью и зимой, более низкие — весной
и летом. В настоящее время используется
ферментативный метод определения
холестерина, с использованием стандартных
коммерческих наборов реактивов.

а)
Определение
содержания общего ХС в сыворотке крови
проводят с помощью холестеролоксидазной
реакции.

Принцип
метода: Метод
колориметрический, энзиматический с
эстеразой и оксидазой холестерина.

Холестерол
и его эфиры выделяются из липопротеинов
с помощью детергентов. Холестеролэстераза,
содержащаяся в наборе реактивов,
гидролизует эфиры. В результате
последующего окисления ХС холестеролоксидазой
образуется пероксид водорода, количество
которого определяется по цветной
реакции.

Эфиры ХС + НОН
————— ХС + ВЖК;

ХС
+ О₂
—————- продукт окисления ХС + Н₂О₂;

Н₂О₂
+ n-хлорфенол
+ 4-аминоантипирин ——— хинониминовый
краситель (розовая окраска) + НОН.

Интенсивность
окраски, развивающейся в ходе реакции,
пропорциональна содержанию ХС в плазме
крови.

Параллельно
исследуемой сыворотки крови (образец
исследуемый ОИ) проводят обработку
стандартной пробы (образец стандартный
ОС), в которую вместо сыворотки вносят
такой же объем калибровочного раствора
ХС (концентрация которого указана на
этикетке бутылька, входящего в состав
набора). Интенсивность развившегося
окрашивания измеряют, фотометрируя при
550 нм против холостой пробы, которую
ставят также, как и опытную, но вместо
исследуемого материала берут воду.
Расчёт результатов проводят по формуле:

Концентрация
₌оптическая
плотность (ОИ)
_*
концентрация

холестерина
оприческая плотность (ОС) стандарта

б)Определение
содержания ХС ЛПВП

Исследование
уровня общего ХС не даёт диагностической
информации об определённом заболевании,
а характеризует только наличие патологии
обмена липидов и ЛП. Эпидемиологические
исследования показали обратную
зависимость между содержанием ХС ЛПВП
и распространённостью ИБС. Для оценки
состояния липидного обмена и прогнозирования
риска ИБС определяют величины ХС ЛПВП.

Принцип
метода: ХМ,
ЛПОНП и ЛПНП, содержащиеся в исследуемой
пробе осаждают добавлением
фофорно-вольфрамовой кислоты и хлорида
магния. Осадок отделяют центрифугированием.
ЛПВП остаются в растворе. ХС, содержащийся
в этой фракции, определяют ферментативно
(см выше). Нормальное содержание ХС ЛПВП
в сыворотке крови составляет 0,9-1,9
ммоль/л.

в)Определение
содержания ХС ЛПОНП и ХС ЛПНП

Для определения
ХС ЛПОНП и ХС ЛПНП используют расчёты.

ХС ЛПОНП = ТАГ(ммоль/л)
: 2,18;

ХС ЛПНП = ОХ – (ХС
ЛПВП+ ХС ЛПОНП).

Определение этих
величин позволяет рассчитать индекс
атерогенности (ИА):

ИА = (ХС ЛПНП + ХС
ЛПОНП) : ХС ЛПВП.

Индекс
атерогенности выше 2,5 характеризует
вероятность развития атеросклероза.

Чаще
наблюдается гиперхолестеринемия
(атеросклероз, обострение желчнокаменной
болезни, ишемическая болезнь сердца,
микседема и др.), реже регистрируется
гипохолестеринемия(у
тяжёлых алкоголиков, при тиреотоксикозе).

Каким анализом определить глюкозу?

Проводить анализ крови можно в лаборатории или в домашних условиях. Почти все методы лабораторных анализов предполагают забор крови из вены или пальца. И хоть данный анализ не требует специальной подготовки. Есть факторы, которые могут повлиять на результаты:

Анна Поняева. Закончила нижегородскую медицинскую академию (2007-2014) и Ординатуру по клинико-лабораторной диагностике (2014-2016).Задать вопрос>>

• Сильная физическая нагрузка накануне сдачи анализа.
• Сильное эмоциональное потрясение.
• Переедание или чрезмерное употребление алкогольных напитков.
• Также стоит помнить о том, что не следует перед анализом крови 2-3 дня использовать лекарственные препараты.

Если кровь для анализа берут из вены, делать это нужно утром, натощак.

Если же для анализа используют кровь из пальца, ее забор можно совершать в любое время суток. На качество лабораторного исследования могут влиять такие факторы:

• время забора крови;
• материал пробирок или качество системы для забора крови;
• положение тела пациента;
• квалификация медицинских сотрудников.

Хранение и транспортировка образца очень важна для правильного результата. Для этого используют специальные системы вакуумного хранения, которые надежно защищают образец от внешних факторов.

Такие контейнеры защищают от солнца и света, образцы крови в них могут храниться до 2 суток.

Редуктометрические методы

Редуктометрические методы, основанные на свойстве сахара восстанавливать в щелочной среде соли тяжелых металлов. К ним относятся: Титрометрический метод Хагедрона и Йенсена (1923), в котором используется свойство сахаров восстанавливать при кипячении в щелочной среде железосинеродистый калий (красную кровяную соль) в железистосинеродистый калий (желтую кровяную соль). По степени этого восстановления титрометрически определяют концентрацию сахара в крови. Однако ввиду того, что в крови присутствуют ряд соединений, не относящихся к углеводам, но обладающих восстановительными свойствами (мочевая ктслота, глютатион, креатинин), полученный результат включает всю сумму восстанавливающих соединений, содержащихся в крови, и получаемое редуктометрическими методами количество сахара в крови оказывается значительно выше истинного количества глюкозы. В этом состоит недостаток всех редуктометрических методов. Но они, тем не менее, сохраняют свое клиническое значение, поскольку разность между «кажущимся» сахаром крови и «истинной» глюкозой (так называемая остаточная редукция) у одного и того же лица есть величина постоянная, не зависящая, в частности от введения инсулина или приема глюкозы. Однако данные методы недостаточно специфичны и не точны, а также трудоемки (вследствие использования большого количества реактивов). Вследствие чего данные методы практически не используются в клинической лабораторной диагностике. Ниже приводится схема реакций методом Хагедорна-Иенсена: белки крови + ZnSO4 —> денатурация и осаждение глюкоза + К3 —> глюконовая кислота + К4 К3 (избыток) + KI —> I2 + К4 I2 + крахмал —> синяя окраска I2 + Na2S2O3 (титрование) —> —> Na2S4O6 + NaI (синяя окраска исчезает)

Глюкоза в крови

Определение глюкозы в крови – один из наиболее широко распространенных тестов в клинической лабораторной диагностике. Глюкозу определяют в плазме, сыворотке, цельной крови. Согласно Руководству по лабораторной диагностике диабета, представленному Американской Ассоциацией диабета (2011 г.), не рекомендуется измерять глюкозу в сыворотке крови при диагностике диабета, поскольку именно использование плазмы позволяет быстро центрифугировать образцы, чтобы предотвратить гликолиз, не дожидаясь образования сгустка.

Различия в концентрации глюкозы в цельной крови и плазме требуют особого внимания при трактовке результатов. Концентрация глюкозы в плазме выше, чем в цельной крови, причем различие зависит от величины гематокрита, следовательно, использование некоего постоянного коэффициента для сопоставления уровня глюкозы в крови и плазме может привести к ошибочным результатам. Согласно рекомендациям ВОЗ (2006 г.), стандартным методом для определения концентрации глюкозы должен быть метод определения глюкозы в плазме венозной крови. Концентрация глюкозы в плазме венозной и капиллярной крови не отличается натощак, однако через 2 ч после нагрузки глюкозой отличия существенны (Табл.).

Концентрация глюкозы, ммоль/л
Цельная кровь	Плазма
венозная	капиллярная	венозная	капиллярная
Норма
Натощак	3,3–5,5	3,3–5,5	4,0–6,1	4,0–6,1
Через 2 часа после ПГТТ	6,7 7,8 7,8 8,9 6,1	>6,1	>7,0	>7,0
Через 2 часа после ПГТТ	>10,0	>11,1	>11,1	>12,2

На уровень глюкозы в биологическом образце значительное влияние оказывает его хранение. При хранении образцов при комнатной температуре в результате гликолиза происходит существенное снижение содержания глюкозы. Для ингибирования процессов гликолиза и стабилизации уровня глюкозы в пробу крови добавляют фторид натрия (NaF). При взятии образца крови, согласно докладу экспертов ВОЗ (2006 г.), если немедленное отделение плазмы невозможно, образец цельной крови должен быть помещен в пробирку, содержащую ингибитор гликолиза, которую следует хранить во льду до выделения плазмы или проведения анализа.

• Диагностика и мониторинг СД;
• заболевания эндокринной системы (патология щитовидной железы, надпочечников, гипофиза);
• заболевания печени;
• ожирение;
• беременность.

Особенности взятия и хранения образца. Перед исследованием необходимо исключить повышенные психо-эмоциональные и физические нагрузки.

Предпочтительно – плазма венозной крови. Образец следует отделить от форменных элементов не позднее, чем через 30 мин после взятия крови, избегать гемолиза.

Образцы стабильны не более 24 ч при 2–8 °C.

Метод исследования. В настоящее время в лабораторной практике наибольшее распространение получили ферментативные методы определения концентрации глюкозы – гексокиназный и глюкозооксидазный.

• СД 1 или 2 типа;
• диабет беременных;
• заболевания эндокринной системы (акромегалия, феохромоцитома, синдром Кушинга, тиреотоксикоз, глюкоганома);
• гемахроматоз;
• панкреатит острый и хронический;
• кардиогенный шок;
• хронические заболевания печени и почек;
• физические упражнения, сильное эмоциональное напряжение, стресс.

• Передозировка инсулина или гипогликемических препаратов у больных СД;
• заболевания поджелудочной железы (гиперплазия, опухоли), вызывающие нарушение синтеза инсулина;
• дефицит гормонов, обладающих контринсулярным действием;
• гликогенозы;
• онкологические заболевания;
• тяжелая печеночная недостаточность, поражения печени, вызванные отравлением;
• заболевания ЖКТ, нарушающие всасывание углеводов.
• алкоголизм;
• интенсивная физическая нагрузка, лихорадочные состояния.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 — 2020

Центральный офис: 111123, Россия, Москва, ул. Новогиреевская, д.3а, метро «Шоссе Энтузиастов», «Перово» +7 (495) 788-000-1, info@cmd-online.ru

28.2.2. Проба Либена на кетоновые тела

При взаимодействии
ацетона с йодом в щелочной среде
образуется йодоформ, о присутствии
которого судят по появлению жёлтого
осадка и характерному запаху.

Ход определения

К 10 каплям исследуемой
мочи прилейте 1-2 капли 10%-го раствора
NaOH
и по каплям раствор Люголя (J₂
в KJ)
до появления бледно-жёлтого помутнения.
Регистрируется запах йодоформа.

Контроль
выполнения лабораторной работы

1. С помощью каких
реакций можно обнаружить глюкозу в
моче?

2. Объясните химизм
проб Фелинга и Троммера.

3. Чем выгодно
отличается реакция Фолинга от пробы
Троммера?

4. Присутствие
каких веществ, кроме глюкозы, может
регистрироваться в моче при сахарном
диабете?

5. С помощью каких
реакций можно доказать наличие кетоновых
тел в моче?

6. Почему при
проведении пробы Легаля мешает присутствие
креатинина? Как решается эта проблема?

7. Что лежит в основе
пробы Либена?

Темы
рефератов:

1. Этнические и
   возрастные особенности сахарного
   диабета.

2. Механизмы
   гиперволемии при сахарном диабете.

3. Острые осложнения
   сахарного диабета.

4. Дифференциальная
   диагностика различных ком при сахарном
   диабете.

5. Биохимические
   отличия сахарного диабета от стероидного,
   несахарного, тироидного диабетов.

6. Диабет беременных.

Методы

Есть несколько методов, которые могут быстро измерить уровень сахара в крови. Наиболее популярными считаются:

• Ферментативный;
• Гексокиназный метод.

Раньше использовались также редуктометрический и колорометрический, но из-за токсичности и низкой точности они больше не используются в современной медицине.

Ферментивный метод определения глюкозы в крови условно делится на:

используется еще с начала века

Поэтому такой метод считают линейным, с ошибкой в 30ммоль/л.

Гексокиназный метод

Такой метод считают референтным по измерению уровня глюкозы в крови, но наиболее точным, так как не взаимодействует с компонентами сыворотки крови. Чаще всего этот метод используют в эндокринологических отделениях. Сотрудники лаборатории могут предложить способы проведения такого анализа:

• провести обследование при помощи автоматического биохимического анализатора;
• автоматический фотометр, который используют в небольших лабораториях;
• в экстренных ситуациях удобным будет карманный глюкометр (One Touch).

Достаточно быстро можно определить уровень глюкозы в крови каждого человека.

Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону

Реактивы.
Трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор;
сульфат меди (II), 20%-ный и 4%-ный растворы;
оксид кальция, порошок, навеска 0,5 г;
серная кислота, конц.; n-гидроксидифенил,
свежеприготовленный щелочной раствор
(50 мг n-гидроксидифенила растворяют в 3
мл 3%-ного раствора гидроксида натрия).

Оборудование.
Водяная баня с лабораторным термометром;
штатив с пробирками; пипетки на 0,1 и 1
мл; стеклянные палочки; центрифуга с
центрифужными весами; ФЭК.

Материал.
Кровь, взятая из пальца.

Метод
основан на способности молочной кислоты
при нагревании с концентрированной
серной кислотой переходить в ацетальдегид,
дающий с n-гидроксидифенилом характерную
фиолетовую окраску, интенсивность
которой пропорциональна концентрации
молочной кислоты:

Ход
определения.
В центрифужную пробирку отмеривают 0,5
мл дистиллированной воды и вносят в нее
0,1 мл крови, взятой микропипеткой из
пальца обследуемого. Микропипетку
промывают той же водой.

К
содержимому пробирки добавляют 1 мл
раствора уксусной кислоты и помещают
ее на 10 мин в лед (для лучшего осаждения
белков), после чего центрифугируют 5 мин
при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают
в чистую центрифужную пробирку, добавляют
0,5 мл 20%-ного раствора сульфата меди и
0,5 г порошка оксида кальция и тщательно
перемешивают стеклянной палочкой.
Появляется голубое окрашивание (если
окрашивание зеленоватое, то проба
дальнейшей обработке не подвергается).
Смесь оставляют
стоять на 30 мин, периодически помешивая
стеклянной палочкой. Затем ее центрифугируют
5 мин при 100 об/мин.

Надосадочную
жидкость сливают в чистую пробирку,
приливают 1 каплю 4%-ного сульфата меди
и осторожно наслаивают 3 мл концентрированной
серной кислоты, погрузив при этом
пробирку в лед и непрерывно помешивая
содержимое стеклянной палочкой. После
этого пробирку помещают в кипящую
водяную баню на
5 мин и затем охлаждают ее в водяной бане
до 20˚С

К
охлажденной смеси приливают 1 каплю
(0,05 мл щелочного раствора n-гидроксидифенила
и ставят пробирку в водяную баню при
30˚С на 30 мин, время от времени взбалтывая
содержимое. В пробирке за это время
развивается голубое окрашивание.
Пробирку помещают на 90 с (точно!)
в бурно кипящую водяную баню. За это
время голубая окраска переходит в
фиолетовую. Затем смесь охлаждают и
фотометрируют на ФЭКе при 540 нм (светофильтр
зеленый) в кювете с толщиной слоя 1,0 см
против воды.

Расчет.
Содержание молочной кислоты х (ммоль/л)
рассчитывают по формуле

с1000

х
= ————— ,

0,1∙1000

где
с – количество молочной кислоты в пробе,
найденное по калибровочному графику,
ммоль;

0,1
– объем крови, взятый на исследование,
мл;

1000
в числителе – коэффициент пересчета
на 1 л крови;

1000
в знаменателе – коэффициент перевода
микромолей в миллимоли.

Оформление
работы.
Рассчитать содержание молочной кислоты
в крови обследуемого. В выводе указать
на возможные сдвиги концентрации
молочной кислоты и их причины.

Практическое
значение работы.
В норме содержание молочной кислоты в
крови составляет 0,50-2,0 ммоль/л. Увеличение
ее содержания может наблюдаться при
усиленной мышечной работе, при
заболеваниях, сопровождающихся развитием
гипоксии (недостаточность сердечной
деятельности, хронические бронхиты,
анемия и т.д.).

Работа №1. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Принцип метода.Ферментативный метод определения
глюкозы основан на действии глюкозооксидазы
и предназначен для специфического
определения глюкозы в биологических
жидкостях в присутствии различных
сахаров и других редуцирующих веществ
неуглеводной природы. Глюкозооксидаза
(КФ 1.1.3.4) относится к флавопротеинам
(кофермент – ФАД). Глюкоза окисляется
при действии фермента с образованием
Н₂О₂и глюконата. Возникшую
перекись водорода определяют реакцией,
катализируемой ферментом пероксидазой,
с последующим окислительным азосочетанием
производного фенола с 4-аминофеназоном
(хромогенный кислородный акцептор). В
ходе реакции образуются окрашенные в
розовый цвет продукты. Количественное
определение глюкозы заключается в
измерении интенсивности окраски
красителя и сравнении оптической
плотности испытуемой пробы с окраской
калибровочного раствора глюкозы.

Порядок выполнения работы:

1). В пробирку №1 (опыт) вносят 0,01 мл
сыворотки крови и 1 мл рабочего раствора
(ферментно-хромогенная смесь)

2). В пробирку №2 (контроль) вносят 0,01 мл
стандартного раствора глюкозы
(концентрация глюкозы 10 ммоль/л) и 1 мл
рабочего раствора

3) Пробирки перемешивают и инкубируют
в термостате 30 минут при 37оС

4) Измеряют оптическую плотность опытной
пробы (А_опыта) и контроля (А_{контроля})
на ФЭКе против дистиллированной воды
при длине волны 540 нм в кювете с толщиной
оптического слоя 3 см

5) Рассчитывают содержание глюкозы по
формуле:

Глюкоза (ммоль/л) = (10×А_опыта)
: А_{контроля}

В выводах сопоставить величины нормального
содержанию глюкозы в крови с данными,
полученными в результате проделанной
работы. На основании сопоставления
сделать заключение о норме или отклонении
от нее (гипергликемия, гипогликемия)

Клинико-диагностическое значение.Благодаря существованию ряда сложных
нервных и гуморальных регуляторных
механизмов концентрация глюкозы в крови
сохраняется относительно постоянной
– 3.3-5.5 ммоль/л. Концентрация глюкозы в
крови зависит от строгой регуляции
интенсивности процессов распада и
синтеза гликогена, глюконеогенеза,
скорости всасывания глюкозы в ЖКТ и
окисления ее в тканях с высвобождением
энергии.

Гипогликемия– понижение
содержания глюкозы в крови. Гипогликемия
наблюдается при длительном голодании;
сопровождает заболевания поджелудочной
железы, опухолевый рост, тяжелые поражения
печени, эндокринные нарушения; наблюдается
при передозировке инсулина. При
гипогликемии ниже 2.7 ммоль/л возникает
риск развития гипогликемичекой комы.

Гипергликемия –повышенное
содержание глюкозы в крови (более 6
ммоль/л). Физиологическая гипергликемия
наблюдается после приема пищи, при
эмоциональном стрессе. Гипергликемия
сопровождает эндокринные нарушения
(сахарный диабет, тиреотоксикоз и др.),
заболевания поджелудочной железы
(острый и хронический панкреатиты),
хронические заболевания печени и почек,
сердечно-сосудистые заболевания и др.
При гипергликемии выше 22 ммоль/л
развивается гипергликемическая кома.

Работа №2

28.2.1. Проба Легаля на кетоновые тела

Ацетоуксусная
кислота, ацетон реагируют в щелочной
среде с нитрогруппой нитропруссида
натрия, образуя комплексные анионы
красно-коричневого цвета. Подобным
образом проходит реакция с нормальным
компонентом мочи – креатинином. Однако
в кислой среде продукт, получившийся
из креатинина, распадается, и буро-красный
цвет переходит в жёлтый. А комплексы,
образовавшиеся из кетоновых тел, в
кислой среде протонируются, давая
вишнёво-красное окрашивание.

Ход определения

К 10 каплям исследуемой
мочи добавьте 1-2 капли свежеприготовленного
10%-го раствора нитропруссида натрия,
3-4 капли 10%-го раствора NaOH.
При наличии кетоновых тел развивается
буро-красное окрашивание. При подкислении
жидкости концентрированной СН₃СООН
раствор приобретает вишнёво-красный
цвет.

Уробилиноиды в моче

Уробилиноиды:
уробилиногены (уробилины) и стеркобилиногены
(стеркобилины).

Качественные
пробы на уробилиноиды:

1. Проба Богомолова:
10—15 мл мочи + 2—3 мл насыщенный раствор
сульфата меди, ч/з 5 мин+ 2-3 мл хлороформа,
взболать. Розово-красное окрашивание
(при наличии).

2. Проба Флоранса:
6-10 мл мочи, подкисленной 8-10 кп HCl,
+ 2-3 мл диэтилового эфира. Эфирный слой
отобрать, наслоить на 2-3 мл конц. HCl.
Красное кольцо (при наличии уробилина).

Проба положительна
у здоровых!
Используется для установления факта
полного отсутствия в моче уробилиновых
тел.

Уробилинурия
— при паренхиматозных поражениях
печени гемолитических анемиях, некоторых
заболеваниях кишечника (энтериты,
запоры, кишечная непроходимость)

Как провести тест?

Чтобы аппарат выдавал стабильный, точный результат следует:

• Хранить аппарат в хороших условиях, без сильных перепадов температур и высокой влажности.
• Полоски для теста должны сохраняться в защитном контейнере.

Перед проведением теста нужно:

• Тщательно вымыть руки, а место прокола продезинфицировать спиртовой салфеткой.
• После прокола кожу нужно обработать антисептиком.
• Проводить забор крови для теста лучше в ванной комнате.
• Игла должна быть простерилизована.
• Глубину и место прокола должен определить лечащий врач.

Кровь на полоске должна аккуратно прислоняться к глюкометру, внимательно следовать инструкции в зависимости от типа аппарата. Проводить забор крови нужно не более 4 раз в сутки.