Метод циля

Метод Бурри

Техника. Каплю исследуемой культуры смешивают на пред­метном стекле с каплей туши, затем с помощью другого стекла, поставленного к первому под углом в 45, делают тон­кий мазок по принципу приготовления мазков из крови.

Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют нефиксированным.

При использовании раствора конго рот после высушива­ния мазок обрабатывают 1% раствором соляной кислоты в аб­солютном алкоголе, затем высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: на окрашенном фоне ясно видны неокрашенные светлые микробные клетки.

ОКРАСКА ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В микробиологической работе наиболее употребительны способы окраски фиксированных микроскопических препаратов, кото­рые в основном можно разделить на две группы: ориентировоч­ные, или простые, и дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности того или иного вида микроорганизма.

Простые методы окраски микробов

Простые методы окраски препаратов предполагают использование одного анилинового красителя и позволяют изучить такие морфологические признаки микроорганизма, как форму, размеры, расположение в мазке. Для этих целей используется ряд красителей: метилено­вый синий, фуксин и др.

Нарисуем невидимое, или Методы окраски микроорганизмов

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше. Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло. «Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

• ярко-синими (грамположительные);
• бесцветными (грамотрицательные).

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

• витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
• поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
• негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Работа с фиксированными препаратами

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время. То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.

Контрольные вопросы.

Перечислите и
охарактеризуйте основные этапы развития
микробиологии. Назовите основные
открытия Л. Пастера, Р. Коха, И.И. Мечникова.
Заслуги отечественных учёных в развитии
микробиологии. Назовите отрасли
микробиологии, разделы медицинской
микробиологии. Значение микробиологии
в работе врача-стоматолога. Положение
микроорганизмов среди других живых
существ. Перечислите основные группы
микроорганизмов. По каким признакам
отличаются между собой эукариоты и
прокариоты? Основные формы бактерий.
Как называется кокки, располагающиеся:
попарно, цепочкой, гроздьями, по четыре,
пакетами? Как называются палочки,
образующие споры? Как называются палочки,
не образующие споры? Как называются
извитые формы с одним завитком спирали?
Как называются извитые формы с несколькими
завитками? Методы исследования в
микробиологии. Микроскопический метод:
что изучает, с помощью чего? Устройство
светового микроскопа. Что такое
иммерсионная система? Правила работы
с иммерсионной системой. Что такое
разрешающаяспособность микроскопа и
чему она равна у микроскопа с иммерсионной
системой? Какова роль иммерсионного
масла? Каким свойством должно обладать
иммерсионное масло? Куда помещают
иммерсионное масло при микроскопии?
Нужно ли применять иммерсионное масло
при микроскопии с объективом: x8, x40, x90?

Этапы
приготовления препарата-мазка. Для чего
фиксируют мазок? Способы фиксации
мазков. Какие способы окраски называются
простыми? Какие красители применяются
для окраски бактерий? Какие способы
окраски называются сложными, на чём они
основаны? Как производится окраска по
Граму в модификации Синёва: в какой цвет
окрашиваются грамположительные бактерии,
почему? В какой цвет окрашиваются
грамотрицательные бактерии, почему?
Чем обусловлена способность бактерий
различно окрашиваться по Граму? Какие
бактерии (кокки, палочки, извитые)
красятся по Граму положительно и какие
отрицательно? Из каких слоёв состоит
клеточная стенка грамположительных и
грамотрицательных бактерий? Принцип и
техника окраски по Цилю-Нильсену. Какие
патогенные бактерии являются
кислотоустойчивыми?

Флуорохромирование аурамином

Техника.
Фиксированный препарат окрашивают
смесью аурамина 00 (0,12 г), карболовой
кислоты (5 мл), дистиллированной воды
(до 100 мл). Краситель нали­вают на мазок,
подогревают на пламени до появления
паров. Через 10 мин препарат промывают
водой и обесцвечивают 15 с солянокислым
спиртом. Препарат промывают и подсушивают
на воздухе.

Микроскопическая
картина.
Туберкулезные микобактерии флуоресцируют
золотисто-желтым цветом.

Окраска акридиновым
оранжевым

Техника.
Мазки, фиксированные 3-5 мин метиловым
спиртом, погружают в раствор (1:10000)
краси­теля, к 10 мл которого добавлено
3-5 капель 10% раствора ам­миака. Через
24 ч препарат обесцвечивают 3% солянокислым
спиртом (дважды по 10 с), промывают и
высушивают.

Микроскопическая
картина.
Туберкулезные микобактерии флуоресцируют
желто-оранжевым цветом.

Флуорохромирование
акридиновым желтым

Техника.
Мазок на 30 с помещают в водный раствор
(1:5000) флуорохрома, затем про­мывают.
Дифференцируют солянокислым спиртом
15 с, вновь про­мывают и высушивают.

Микроскопическая
картина.
Туберкулезные микобактерии флуоресцируют
желтым цветом.

Окраска спор

Бактериальные
споры, отличающиеся от вегетативных
клеток многослойной липидосодержащей
оболочкой, пропитанной депиколатом
кальция, не поддаются окраске простыми
методами и по Граму. Для окраски спор
разработаны специальные методы,
направленные на увеличение их проницаемости
с использованием растворов кислот,
концентрированных красителей и подогрева.

Способ Пешкова

Техника.
На мазок, фиксированный жаром (над
пламе­нем!), наливают синий Леффлера
и подогревают стекло до заки­пания
краски. Дают 15-20 с покипеть, а затем
(после того как стекло остынет!) промывают
водой и докрашивают препарат 30 с 0,5%
водным раствором нейтрального красного.
Вновь промы­вают, сушат и микроскопируют.

Микроскопическая
картина.
Споры окрашиваются в голу­бой цвет,
клетки – в розовый.

Способ Ганзена

Техника.
Препарат, приготовленный обычным
способом, при нагревании окрашивают
1-2 мин карболовым фуксином Циля, промывают
водой и обесцвечивают, погружая стекло
в 2% рас­твор азотной кислоты в спирте
или в 1 % водный раствор сер­ной кислоты.
Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате
не было видно следов красителя. Затем
промывают водой и докра­шивают водным
раствором метиленового синего.

Микроскопическая
картина.
Споры окрашиваются в крас­ный цвет.

Метод Ожешки

Техника.
На нефиксированный мазок наливают 0,5%
рас­твор хлористоводородной кислоты
и подогревают 1-2 мин. С препарата сливают
кислоту, промывают его водой и после
высы­хания фиксируют на пламени.
Фиксированный препарат красят по способу
Циля-Нильсена.

Микроскопическая
картина.
Тела бактерий окрашиваются в синий
цвет, споры – в красный (рис.16).

Метод Виртца в
модификации Саватеева

Приготовление
растворов.
К насыщенному водному рас­твору
(около 5%) малахитового зеленого добавляют
5% глице­рина, пропитывают смесью
полоски фильтровальной бумаги и
вы­сушивают их (лучше при 50С).
Затем готовят 0,5% водный рас­твор
сафранина, которым смачивают другие
полоски фильтро­вальной бумаги и
высушивают.

Техника.
На фиксированный над пламенем мазок
наносят 2-3 капли дистиллированной воды
и накладывают по­лоску фильтровальной
бумаги, окрашенной малахитовым зеленым.
Препарат нагревают над пламенем горелки
до появления паров (3-4 раза), приблизительно
в течение минуты. При испарении воды ее
добавляют. После остывания препарата
краску с бумаж­кой смывают струей
воды (полминуты) и сейчас же на мокрую
поверхность препараты кладут бумажку,
окрашенную сафранином. Через 30-40 секунд
мазок промывают водой, высушивают и
микроскопируют.

Микроскопическая
картина.
Свободно лежащие споры – зе­леновато-голубого
цвета, споры внутри микробных клеток –
темно-зеленые, вегетативные формы
микробов – красные.

Состав набора для окраски по Граму

• Карболовый раствор генциана фиолетового, 25 мл — 1 фл.
• Раствор Люголя, 25 мл — 1 фл.
• Водный раствор фуксина Циля, 2,5 мл — 1 фл.
• Инструкция по применению набора для окраски по Граму — 1 шт.

Приготовление набора для окраски по Граму

Основной фуксин Циля разводят в 10 раз дистиллированной водой
перед использованием. Для этого к содержимому флакона с надписью
«Основной фуксин Циля» добавляют 22,5 мл дистиллированной воды.

Использование набора для окраски по Граму

Предметное стекло перед исследованием обезжиривают и делают
на нем мазки исследуемых культур. Мазки следует делать тонкими,
чтобы клетки равномерно распределялись на поверхности стекла и не
образовывали скоплений. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют
над пламенем горелки (спиртовки) и выполняют следующие действия:

• на мазок кладут полоску фильтровальной бумаги;
• наносят 2-3 капли из капельницы (50-75 мкл) карболового раствора генциана фиолетового (входит в состав набора для окраски по Граму);
• выдерживают в течение 2 мин;
• удаляют фильтровальную бумагу;
• наносят 2-3 капли из капельницы (50-75 мкл) раствора Люголя (входит в состав набора для окраски по Граму);
• выдерживают в течение 1 мин;
• сливают остатки красителя и раствора Люголя;
• обесцвечивают в течение 30-45 сек 96-градусным этиловым спиртом;
• промывают водой;
• наносят 2-3 капли из капельницы (50-75 мкл) водного раствора фуксина (входит в состав набора для окраски по Граму);
• выдерживают в течение 2 мин;
• сливают краситель;
• промывают препарат водой;
• высушивают на воздухе;
• микроскопируют с иммерсионной системой.

Учет и интерпретация результатов, полученных на базе набора для окраски по Граму

При правильном окрашивании грамположительные бактерии
имеют сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — розово-красный.

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

• витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
• поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
• негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Витальный метод, безусловно, самый опасный, так как исследователям приходится иметь дело с живыми клетками, иногда представляющими смертельную опасность. Однако именно такой способ дает возможность изучать не только строение клетки, но и весь ее жизненный цикл и взаимодействие с окружением.

Для многих микробиологических исследований важно сохранить бактерии живыми. Это значит, что нужно использовать специальные нетоксичные или низкотоксичные красители, к тому же легко проникающие в структуру клетки через наружную оболочку

Это так называемые витальные красители, они могут быть предназначены для видимого света или флуоресцентными. По химическому составу красители разделяются на:

• основные (акридиновый оранжевый, метиленовый синий);
• кислотные или кислые (индигокармин, кислый фуксин);
• нейтральные (родамин В).

Морфология грибов.

Грибы
и простейшие имеют четко ограниченное
ядро и относятся к эукариотам. Грибы
крупнее бактерий, в эволюционном плане
близки к растениям (наличие клеточной
стенки, содержащей хитин или целлюлозу,
вакуолей с клеточным соком, неспособность
к перемещению, видимое движение
цитоплазмы). Ядерный материал грибов
отделен от цитоплазмы ядерной мембраной.
Дрожжевые
грибы образуют отдельные овальные
клетки. Плесневые
грибы формируют клеточные нитеподобные
структуры- гифы.
Мицелий—
переплетение гифов- основная морфологическая
структура. При вегетативном размножении
образуются специализированные
репродуктивные структуры- споры- конидии.
Они могут располагаться в специализированных
вместилищах- спорангиях
(эндоспоры) или отшнуровываться от
плодоносящих гиф (экзоспоры). Актиномицеты
— формы бактерий, имеющие истинный, не
имеющий перегородок мицелий. Мицелиальный
(в виде ветвящихся нитей) рост этих
грамположительных бактерий придает им
внешнее сходство с грибами. Это сходство
усиливается вследствие наличия у высших
форм актиномицетов наружных неполовых
спор, которые называются конидиями.В
отличие от грибов, актиномицеты имеют
прокариотическое строение клетки, не
содержат в клеточной стенке хитина или
целлюлозы, размножаются только бесполым
путем. Представители рода Mycobacterium,
в который входят возбудители туберкулеза,
являются кислотоустойчивыми
микроорганизмами, плохо воспринимающими
краски. Их высокая резистентность во
внешней среде , кислотоустойчивость и
ряд других свойств связан с особым
составом клеточной стенки, большим
содержанием липидов и воска.У представителей
родов Actinomyces
и Nocardia
мицелий выражен в значительно большей
степени, чем у микобактерий, однако в
старых культурах они также проявляют
тенденцию фрагментироваться на отдельные
клетки неправильной формы. Микроорганизмы
рода Actinomyces
являются анаэробами, Nocardia
— аэробами, многие из которых проявляют
кислотоустойчивость. Микроорганизмы,
относящиеся к высшим актиномицетам
(рода Streptomyces,
Micromonospora)
образуют мицелий и размножаются наружными
неполовыми спорами или конидиями.
Обычным местом обитания для большинства
из них является почва.

1)
Архимицеты
– наиболее примитивные, микроскопических
размеров; зачаточный мицелий или нет
мицелия; тело представляет собой голый
комочек протоплазмы, который покрывается
оболочкой в процессе превращения в
спорангий; размножаются бесполым путем
посредством подвижных спор – зооспор,
развивающихся в спорангие. Явл.
внутриклеточными паразитами низших и
высших растений. Z.B.
Ольпидиум Olpidium
brassicae;
Синхитриум Synchytrium
endobioticum.

2)
Фикомицеты
– хорошо развитый одноклеточный,
многоядерный мицелий; бесполое размножение
происходит при помощи неподвижных
спорангиеспор или подвижных зооспор,
при половом процессе образуется зигота.
Z.B.
Фитофтора Phytophthora
infenstans;
Мукор Mucor;
Ризопус Rhizopus/

3)
Аскомицеты
– сумчатые грибы, мицелий многоклеточный,
состоит из многоядерных клеток. Бесполым
путем размножаются при помощи конидий;
при половом процессе образуются аскоспоры
в сумках (асках). Голосумчатые – не
образуют плодовые тела Z.B.
эндомицес Enlomyces.
Плодосумчатые — образуют плодовые тела
Z.B.
пенициллиум Penicillium;
аспергилловые Aspergillus
niger,
awamori.

4)
Базидиомицеты
– бесполое размножение редко; основными
органами размножения являются базидии
с базидиоспорами. а) Одноклеточные
базидии: базидии развиваются слоями на
плодовых телах Z.B.
шляпочные, трутовики, домовые грибы.
б) Многоклеточные базидии
– большинство не имеет плодовых тел;
Z.B.
головневые грибы; ржавчинные грибы.
Явл. основной массой съедобных грибов
р. Boletus,
Вешенки, шампиньоны – немикаридные, не
нуждаются в симбиозе с высшими растениями,
могут выращиваться на экстрактах.

5)
Несовершенные
грибы –
многоклет. грибы, половое размножение
не обнаружено; боль-во размножается
конидиями, некоторые образуют оидии,
другие способны к почкованию или не
имеют спец. органов размножения. Z.B.
фузариум, ботритис, оидиум и др.

Применение:
1) экологическое (цикл С); 2) отрицательная
роль: многие грибы вызывают биоразрушения,
выделяя экзоферменты (резина, древесина),
3) биотехнологическое: получение орг.
к-т, антибиотиков, сыров, ферментов.

Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим

В лаборатории применяются анилиновые краски, приготавливаемые из анилина и других производных каменноугольного дегтя. Для окраски препаратов применяются основные и кислые краски. Основные краски хорошо воспринимаются микробами и ядерным хроматином. Кислые краски хорошо окрашивают протоплазму и слабее микроорганизмы.

Кислыми красителями называются свободные окрашенные кислоты или соли этих кислот, обычно соли натрия. Основные красители — это соли красящих оснований, чаще всего хлоргидраты.

Насыщенные спиртовые растворы красок, из которых готовят рабочие краски, хранят в стеклянных банках с притертой пробкой.

Изготовление растворов заключается в следующем.

В флакон с притертой пробкой насыпают 10 г сухой краски, наливают 100 мл 96° спирта ректификата и при ежедневном взбалтывании оставляют раствор на несколько дней, после чего эта краска может быть употреблена для спирто-водных растворов, необходимых для окраски препаратов.

Наиболее часто употребляющиеся растворы красок:

Разведенный фуксин (фуксин Пфейффера)

10 мл карболового фуксина Циля, 90 мл дистиллированной воды. Этот раствор при хранении портится, поэтому его готовят по мере надобности и хранят не более суток.

Карболовый раствор кристалл-виолета

Краски — 1 г Спирта ректификата 96°— 10 мл Кристаллической карболовой кислоты — 2 г Дистиллированной воды — 100 мл

Краску растирают с карболовой кислотой, добавляя спирт, а потом дистиллированную воду, через сутки фильтруют.

Примечание. Вместо кристалл-виолета можно пользоваться насыщенными растворами метил-виолета либо генцианвиолета. Последний при окрашивании выпадет в осадок, в практике он менее применим.

Окраска по методу Синева

Для окраски применяются кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные спиртовым раствором краски. Листы фильтровальной бумаги, разложенные на стекле, обливают 1—2% раствором (в 96° спирте) краски и затем окрашенную высушенную бумагу разрезают на кусочки размером 2X4 см и сохраняют в стеклянных темных банках с притертой пробкой. Приготовленные таким способом бумажки не теряют окрашивающих свойств весьма продолжительное время. Приготовленные препараты красятся в зависимости от исследуемого материала простым либо сложным методом.

К простому методу относится: окраска разведенным фуксином (фуксином Пфейффера), окраска щелочной метиленовой синькой. Окраска разведенным фуксином. На приготовленный на предметном стекле фиксированный на пламени и остывший исследуемый препарат наливают на 1—2 минуты разведенный фуксин. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Окрашивание метиленовой синькой. На приготовленный, высушенный и фиксированный мазок наливают пипеткой метиленовую синьку на 2—3 минуты, после чего препарат смывают водой и высушивают.

Ядра при этом окрашивании более интенсивно воспринимают окраску и резко выделяются над протоплазмой, которая окрашивается слабее.

К сложным методам окраски относятся окрашивания одного и того же препарата растворами нескольких красок в определенном порядке для дифференциации микробов вследствие их сродства к определенным краскам.

В число сложных методов входят: окраска кислотоустойчивых микробов по Циль-Нильсену, окраска по Граму, окраска па Романовскому-Гимза и другие.

— Читать далее «Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму»

Оглавление темы «Микроскопия и подготовка препаратов к микроскопии»: 1.

Микроскопическое исследование. Подготовка материала для микроскопического исследования2. Темнопольная микроскопия. Техника темнопольной микроскопии3. Фазово-контрастная микроскопия. Техника фазово-контрастной микроскопии4. Подготовка материала для электронной микроскопии.

Подготовка материала к окраске5. Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим6. Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму7. Окраска по Романовскому-Гимза. Окраска спор8. Приготовление питательных сред. Требования к питательным средам9. Взятие малых количеств крови. Как брать кровь из пальца для исследований?10. Приготовление мазков крови.

Взятие крови для определения СОЭ

1 2   3   4   5   6   7   8   9   …   40

Первый этап культурального метода исследования – получение изолированного роста чистой культуры

1. Для
   засева берут чашку Петри (или несколько)
   с застывшим и подсушенным агаром (МПА,
   либо агаром Эндо, средой Левина или
   Плоскирева) и пробирку с патологическим
   материалом.

2. В правую руку
   возьмите бактериологическую петлю и
   стерилизуйте ее в пламени спиртовки.

3. В левую руку
   возьмите пробирку с патологическим
   материалом, откройте, пронесите открытую
   часть пробирки через пламя спиртовки,
   прожигая края.

4. Введите петлю в
   пробирку, охладите ее, касаясь изнутри
   стенок пробирки.

5. Погрузите
   прокален­ную и охлажденную петлю в
   патологический
   материал, стряхните избыток жидкости
   (прикасаясь несколько раз к внутренней
   стенке пробирки), пронесите
   открытую часть пробирки через пламя
   спиртовки, прожигая края, пробирку
   закройте проб­кой, поставьте в штатив.

6. Левой
   рукой приоткройте крышку чашки Петри.
   Внесите петлю с исследуемым материалом
   и сделайте параллельные штрихи по ¼
   поверхности
   агара, скользя петлей от одного края
   до другого. Петлю держите плашмя, не
   царапая питатель­ной среды.

7. По
   окончании первой серии посева петлю
   обожгите, поверните чашку против часовой
   стрелки приблизительно на 90 градусов
   и сделайте следующую серию параллельных
   штрихов по незасеянной поверхности
   агара, начиная от конца предыдущего
   посева (серии штрихов), процедуру
   повторите еще два раза, каждый раз
   обжигая петлю после окончания нанесения
   серии штрихов.

8. По
   окончании посева петлю обожгите,
   поставьте в штатив, чашку переверните
   вверх дном, под­пишите и поставьте
   в
   термостат на 24 ч при темпера­туре 37
   С.

§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.

§4. Перед исследованием
мокроту выливают в чашку Петри,
поставленную на темном фоне. Из мокроты
необходимо выбрать гнойные комочки,
приготовить препарат-мазок, окрасить
по Цилю-Нильсену

Промикроскопировать,
обратив внимание на наличие прямых или
слегка изогнутых тонких палочек, часто
зернистых, расположенных одиночно или
группами. Палочки окрашены в красный
цвет, а лейкоциты, посторонние бактерии
и слизь — в синий

Препарат зарисовать.

Если содержание
туберкулезных бактерий настолько мало,
что их не удается обнаружить в мазках,
пользуются одним из методов обогащения
— методом осаждения или методом флотации.

Метод осаждения.
К мокроте добавляют равное по объему
количество однопроцентного едкого
натра, плотно закрывают склянку и
встряхивают ее в течение 5-15 минут до
полного растворения мокроты, центрифугируют,
сливают жидкость, осадок нейтрализуют
1-2 каплями десятипроцентного раствора
соляной кислоты. Из осадка, в котором
сконцентрированы туберкулезные бактерии,
приготовляют мазки, окрашивают по
Цилю-Нильсену и микроскопируют.

Метод флотации.
Мокроту помещают во флакон или колбу с
резиновой пробкой емкостью в 250 мл,
добавляют равное количество 0,5-1% едкого
натра, встряхивают 510 минут до полной
гомогенизации. Колбу помещают в водяную
баню и прогревают при 55°С в течение 30
минут, затем добавляют около 100 мл
дистиллированной воды и 1-2 мл ксилола,
бензина или газолина. Смесь встряхивают
в течение 5-10 минут, еще вливают в колбу
около 100 мл дистиллированной воды (до
установления уровня жидкости в узкой
части горловины) и оставляют при комнатной
температуре на 20-30 минут. Образовавшийся
сливкообразный слой переносят пипеткой
на предметное стекло, которое кладут
на крышку водяной бани, нагретой до
60°С. На высохший мазок наносят новые
порции материала до тех пор, пока весь
флотационный экстракт не будет перенесен
на предметное стекло. Сухой препарат
промывают эфиром для удаления ксилола
или бензина, фиксируют на пламени, красят
по Цилю-Нилъсену и микроскопируют.

§5. Знакомство с
методом микрокультур для ускоренной
диагностики туберкулеза. Демонстрационный
препарат микрокультуры туберкулезной
палочки промикроскопировать и зарисовать.
Микрокультура возбудителя туберкулеза
выглядит в виде тяжей или скоплений,
состоящих из туберкулезных палочек.

§6. Промикроскопировать
и зарисовать готовые препараты палочки
проказы. В отличие от туберкулезной
палочки возбудитель проказы располагается
параллельными рядами (в виде пачек
сигар), преимущественно внутри клеток.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время. То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Способы окраски спор могут быть разными, например, Ожешко или Циля – Нильсена, но все они сводятся к одной схеме:

• разрыхление поверхности спор химическими веществами (кислоты, аммиак, едкий натр);
• окрашивание клетки со спорой (обычно при нагревании);
• обесцвечивание цитоплазмы.

В результате получаем отлично видимую ярко окрашенную спору и бледную, почти прозрачную цитоплазму.

Суть метода

Окрашивание по Цилю-Нильсену позволяет окрасить бактерии, которые устойчивы к воздействию кислот. К таким относятся возбудители туберкулёза, в том числе легочных форм, и лепры. При данной диагностической пробе их окраска получается контрастной по отношению к остальной части мазка.

Сначала подготовленный мазок обрабатывают фуксином Нильсена, нагревают на горелке. Это повторяют несколько раз, добавляя краситель. Затем излишки фуксина смывают водой и обесцвечивают мазок раствором серной кислоты. Следующий этап — окраска метиленовым синим, к которому чувствительно всё, кроме кислотоустойчивых бактерий и структур.

Для диагностики туберкулёза лёгких используют различные методы исследования мокроты, которая выделяется при кашле у пациентов с этой патологией. Этот способ диагностики позволяет дифференцировать болезнь и подтвердить факт выделения микобактерий в окружающую среду.