Андрей Смирнов
Время чтения: ~15 мин.
Просмотров: 3

Как определить концентрацию гемоглобина методом сали

3.3 Подсчет количества эритроцитов

Для
работы необходимы:
микроскоп,
счетная камера Горяева, ме-ланжер для
эритроцитов, 3% раствор хлорида натрия,
покровные стекла, автоматическая
пипетка, пробирки, одноразовый
скарификатор, вата, ан-тисептическое
средство. Объект исследования ― кровь
человека.

Перед началом
работы необходимо рассмотреть счетную
камеру под микроскопом, найти малые
квадратики и большие квадраты сетки
(рису-нок 1). Камеру предварительно
необходимо подготовить путем притирания
покровного стекла к боковым выступающим
граням камеры до появления цветных
(ньютоновских) колец. В каплю свежей
крови, полученной из пальца, погрузить
кончик меланжера (с красной бусинкой в
расширении) для эритроцитов и набрать
кровь до метки 0,5, следя, чтобы в капилляр
не попали пузырьки воздуха. Быстро, пока
кровь не свернулась, перенести кончик
меланжера в 3% раствор хлорида натрия и
набрать его до метки 101, т.е. развести
кровь в 200 раз. После этого взять
заполненный мелан-жер (смеситель), зажать
его концы 1 и 3 пальцами и в течение 1 мин
встря-хивать. После тщательного
перемешивания крови, удалив предварительно
1–2 капли, нанести небольшую капельку
на сетку камеры.

Заполнив камеру,
поместить ее под микроскоп и, если
форменные эле-менты расположены
равномерно (что является показателем
хорошего пе-ремешивания крови), приступить
к подсчету. Считать эритроциты удобнее
при большом увеличении.

Необходимо
подсчитать число эритроцитов в 5 больших
квадратах, рас-положенных в разных
местах сетки, например, по диагонали.
Во избежание двухкратного подсчета
клеток, лежащих на границе между малыми
квадра-тиками, руководствоваться
правилом Егорова, согласно которому,
относя-щимися к данному квадратику
считаются эритроциты, лежащие как внутри
квадратика, так и на его левой и верхней
границе. Эритроциты, лежащие на правой
и нижней границе для данного квадратика
не учитываются.

Формула
для вычисления количества эритроцитов
в 1 мм3
крови:

где:
N

искомое число эритроцитов;

А

число эритроцитов в 80 маленьких
квадратиках (или в 5 больших);

4000
― множитель для получения содержания
эритроцитов в одном мм3
крови;

200 ― степень
разведения эритроцитов.

Повышение
количества эритроцитов в крови —
эритроцитоз
(более 6,0*1012/л
у мужчин и более 5,0*1012/л
у женщин) — один из характерных
лабораторных признаков эритремии.
Эритроцитоз может быть абсолютным
(увеличение массы циркулирующих
эритроцитов вследствие усиления
эритропоэза) и относительным (вследствие
уменьшения объема циркулирующей крови).
Основные причины:

Эритроцитозы
наблюдаются при:


Врожденные и приобретенные пороки
сердца


Легочное сердце


Эмфизема легких


Пребывание на значительных высотах


Болезнь и синдром Кушинга


Лечение стероидами


Дегидратация

ГЕМОГЛОБИНЕМИЯ

ГЕМОГЛОБИНЕМИЯ (haemoglobinaemia; гемоглобин + греч. haima кровь) — повышенное содержание свободного гемоглобина в плазме крови.

У здоровых лиц в плазме содержится лишь незначительное (1—4 мг%) количество свободного гемоглобина. Это гемоглобин, выделившийся из закончивших свой жизненный цикл эритроцитов. В плазме он связывается в основном гаптоглобином (см.), образуя гаптоглобин-гемоглобиновый комплекс, который затем разрушается в клетках ретикулоэндотелиальной системы — в основном в печени, костном мозге, селезенке. С мочой этот высокомолекулярный комплекс не выделяется. Другие белки плазмы также связывают как гемоглобин, так и его гемосодержащие метаболиты. Это плазменные белки: гемопексин, являющийся гемсвязывающим бета1-глобулином с высоким содержанием углеводов (в плазме ок. 100 мг%), и альбумин, образующий с гематином метгемальбумин.

Содержание свободного гемоглобина в плазме меняется в зависимости от интенсивности гемолиза (см.) и гемоглобинсвязывающей способности белков плазмы. При значительном гемолизе Г. сопровождается гемоглобинурией (см.). При гипогаптоглобинемии (врожденной или приобретенной) Гемоглобинурия может возникнуть и при сравнительно небольшой Г.

Как указывают Г. А. Алексеев и Г.. Б. Берлинер (1972), четкой корреляции между уровнем Г. и появлением гемоглобинурии не выявлено. Полагают, что выделение пигмента с мочой может происходить и в отсутствие Г., если распад эритроцитов происходит непосредственно в почках. Известно, что свободный гемоглобин удаляется из плазмы быстрее, чем гаптоглобин-гемоглобиновый комплекс; каждую минуту через почки может выделяться 8—10 мг гемоглобина. Вместе с другими факторами (количество гаптоглобина, реабсорбци-онная способность почечных канальцев) на уровень Г. влияет также интенсивность выделения гемоглобина с мочой.

Суть гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Гемоглобин имеет множество различных форм. Все их пересчитать невозможно. Поэтому используют гемиглобинцианидный метод, который дает возможность определить одну форму – гемиглобинцианид (HbCN). Клетки трансформируется, так как на них воздействуют реактивы:

  • феррицианид калия – переводит гемоглобин в метгемоглобин;
  • цианид калия – образует гемиглобинцианид, который имеет красное окрашивание;
  • дигидрофосфат калия – вещество, с помощью которого реакция ускоряется
  • не ионный детергент – разрушает эритроциты, исключает помутнение раствора, вызванное выделением белков.

Если в лаборатории нет феррицианида калия, гемиглобинцианидный методпроводят с применением ацетонциангидрита, который также образует метгемоглобин. На его основе создан набор реагентов – гемоглобин-АГАТ. Гемиглобинцианидный методс калибратором рассчитан на 600 определений при расходе 5 л рабочего раствора за 1 анализ. Стоимость такого набора не высока, поэтому часто он применяется в клинической лабораторной диагностике.

Методика одобрена Комитетом стандартизации. Поэтому исследование является унифицированным, то есть общепринятым во всех лабораториях. Для анализа необходимо получение капиллярной и венозной крови. В последнем случае результат будет более достоверным. В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, который предотвращает образование сгустков.

Далее ход проведения исследования делится на несколько этапов.

  • Проводят разведение в соотношении 20 микролитров крови на 5 мл реактива. Полученную жидкость перемешивают. Возможно использование центрифуги. Пробирку отстаивают в течение 10 минут.
  • Для исследования жидкости используют фотометр. Он определяет клетки на длине волны 543 нм. В этих пределах измеряется гемиглобинцианид.
  • Дополнительно в прибор устанавливают стандартный раствор, с которым сравнивается полученный результат. Это необходимо для калибровки величины.
  • Полученные данные подставлять в калибровочный график. Для упрощения можно определять концентрацию гемоглобина гемиглобинцианидным методом без калибра. В этом случае используют формулу.

Формула для определения количества гемоглобина:

Hb= Eопт/Eст×C×K×0,001×10

  • Eопт – экстинкция (проницаемость) опытного образца;
  • Eст – экстинкция стандартного образца;
  • С – количество гемиглобинцианида в стандартном образце;
  • К – коэффициент разведения биологической жидкости;
  • 0,001 – число, необходимое для пересчета миллиграммов в граммы;
  • 10 – число для пересчета г% в г/л.

После получения данных возможно их сравнение с нормой. Это может осуществлять пациент, но для постановки точного диагноза и проведения лечения необходимо проконсультироваться с лечащим врачом.

Незначительное отклонение показателя от нормы не говорит о наличии какого-либо заболевания. В этом случае проводят повторное тестирование. Если показатель отклоняется на несколько единицы в нижнюю или верхнюю сторону, врач должен провести дополнительные тестирования, назначить лечение.

Данные по нормальному количеству гемоглобина в исследуемой жидкости записаны в таблице. Число показателя меняется с возрастом, зависит от пола.

Возраст

Женский пол, г/дл

Мужской пол, г/дл

1-3 года

10,5-12,8

10,2-12,6

3-6 лет

10,5-12,9

10,3-12,8

7-13 лет

10,5-13 4

10,8-13,2

От 13 лет и выше

11,5-15,7

14,8-17,4

Что такое гемоглобин и эритроциты?

Красные кровяные тельца – это безъядерные клетки, транспортирующие из легких по всему телу оксиды (диоксид углерода и кислород). В состав этих клеток входит четвертичная белковая глобула – гемоглобин. Данный железосодержащий пептид по своей структуре является тетрамером, состоящим из четырех субъединиц: альфа-1, альфа-2, бета-1, бета-2.

Железосодержащий белок связывает кислород и транспортирует его из легких во все ткани человеческого организма. Также он занимается утилизацией диоксида углерода. Гемоглобин существует в нескольких базовых формах:

  • Дезоксигемоглобин;
  • Карбоксигемоглобин;
  • Оксигемоглобин.

Дезоксигемоглобин – это железосодержащий белок, который циркулирует в кровеносном русле в свободной форме. Он связывает оксиды и образует другие формы железосодержащего белка. Если с дезоксигемоглобином связывается кислород, образуется оксигемоглобин. Данное пептидное соединение способно переносить до 4 молекул кислорода. Если с дезоксигемоглобином связывается оксид углерода (монооксид или диоксид), образуется карбоксигемоглобин.

Эритроциты

Внимание! Стоит отметить, что монооксид углерода в 250 раз эффективнее связывается с железосодержащим белком, чем углекислый газ. Период полураспада карбоксигемоглобина, связанного с монооксидом углерода, относительно велик

Длительный распад обуславливает токсичность данного соединения, из-за чего и возникают отравления угарным газом.

При различных патологических состояниях уровень гемоглобина в кровеносном русле может меняться. Анемия (или малокровие) – это низкий уровень красных кровяных клеток и железосодержащего белка в кровеносном русле. Такое состояние у взрослых зачастую развивается вследствие действия гемолитических ядов или плохого питания.

Методы измерения гемоглобина в крови

Для измерения показателя в крови используют несколько колориметрических способов:

  1. Гемиглобинцианидный.
  2. Гемихромный.
  3. Метод Сали.
  4. Аммиачный.

После любого из методов используют полуавтоматический анализатор, измеряющий спектр длины волны молекулы гемоглобина.

Автоматические методы не смогут распознать нарушения состава крови, но исключат ошибки в подсчёте параметров. Ручной метод используется с применением реактивов и биологической жидкости и способен определить лишь наличие или отсутствие клеток.

Гемиглобинцианидный метод

Гемоглобин имеет много форм, что затрудняет измерение его длины волны. Чтобы сделать процедуру проще, этот показатель переводят в метгемоглобин. Для точности результата используют специальное оборудование: мерные пробирки, фотоэлектроколориметр, трансформирующий раствор. Нормальный показатель длины волны – 540 нм, в этом диапазоне и работает прибор. Расчёты производят по формуле, а итоговый показатель переводят в граммы на литр (г/л).

Интересный факт!

Этот метод применяется для определения уровня гемоглобина все реже, в связи с опасностью для лаборантов, так как реактив может вызвать ожоги кожи и слизистых.

Гемихромный метод

С помощью безопасных специальных реактивов гемоглобин переводят в циангемоглобин. Для этого используют SDS, соли жирных кислот, четвертичный аммоний. В результате образуется гемихром, который также измеряется методом колориметрии в фотометре, при длине волны 540 нм. В конце также используют формулу для расчёта и переводят единицы измерения в г/л.

Плюсом такого метода можно назвать быстроту реакции и получение результата за считанные минуты. Лаборатории часто применяют этот метод с использованием реактивов Ольвекс. Они полностью безопасны, долговечны и экономичны.

Метод Сали

Более устаревший способ анализа, который используют редко. Принцип заключается в добавлении в биоматериал  хлористоводородной кислоты, что помогает перевести гемоглобин в солянокислый гематин. Далее добавляют дистиллированную воду до коричневой окраски и сравнивают цвета с контрольной пробиркой. Отметка на пробирке указывает на количество вещества в 100 г крови. Для получения результата в литре показатели умножают на десять и вычисляют показатель с помощью пропорции.

Аммиачный метод

Этот метод основан на предыдущих, только в качестве раствора используют аммиак 0,04%. Пробу настаивают для перехода всех форм гемоглобина в одну. Далее рассчитывают результат с помощью фотометра при длине волны 543 нм. Наиболее точным считается гемихромный метод. Таким образом можно исключить риск ошибки, так как все расчеты ведут, основываясь на показателях прибора. Кроме того, этот способ наиболее безопасный и не несет вреда для лаборантов.

Гемоглобин — это важный показатель для врача и пациента. С помощью такого анализа можно судить о наличии заболевания, кровотечения и состояния сердечно-сосудистой системы

Важно проводить анализ с целью профилактики, чтобы не допустить анемию или патологическое превышение показателя. Полученные данные лаборатории должны быть интерпретированы врачом

Только так можно избежать осложнений заболеваний и получить правильное лечение.

Виды свободного гемоглобина

Основная масса свободного гемоглобина концентрируется в печени человека, остальное количество находится в плазме. Выделяется два вида такого белка:

  1. Фетальный. Диагностируется только в крови новорожденных малышей. К 10–12 месяцам его структура меняется на обычную, снижается концентрация с 80% до 1%.
  2. Гликированный. Белок формируется при связке с молекулами глюкозы. По его количеству в анализе врачи могут с высокой точностью выявить сахарный диабет на ранней стадии.

На уровень гемоглобина влияет не только возраст пациента: в течение суток он меняется на 5–6%, реагирует на недосыпание, жирную или сладкую пищу, стрессовое состояние человека. Но показатель не используется при комплексной диагностике хронических болезней.

Уровень свободного гемоглобина показывает, насколько слажено и правильно работают органы и системы пациента. Он помогает выявить скрытые воспаления и нарушения внутрисосудистого гемолиза, патологии сердечного клапана, атеросклероз.

Минусы гемихромного метода определения гемоглобина

Методика имеет отрицательные стороны, которые учитываются врачом в постановке диагноза:

  • возможность врачебной ошибки на этапе сдачи крови;
  • возможность неправильного приготовления реактива, использование неверных концентрации для разведения крови;
  • отсутствие возможности рассмотреть форму и размер клеток, фотометр определяет только их количество.

Показания к применению гемихромного метода

Методика для подсчета количества гемоглобина проводится в лабораториях постоянно. Для назначения исследования необходимы различные показания.

  • Диспансеризация человека для определения состояния его здоровья. В этом случае исследование проводят 1 раз в год.
  • Системные заболевания, вызывающие снижение гемоглобина. К ним относят недостаток витаминов и фолиевой кислоты, различные форы анемии, нарушение образования форменных элементов в костном мозге.
  • Проверка здоровья беременной женщины. Во время беременности показатели могут быть незначительно или резко снижены. В первом случае терапевтические меры не требуются. Если показатель снижен значительно, назначают препараты, способствующие его повышению, так как дефицит гемоглобина может негативно сказаться на росте формирование плода.
  • Проверка количества гемоглобина во время лечения. Врач корректирует дозировку лекарственных препаратов или заменяет их на другие медикаменты.

Возможные ошибки в применении гемихромного метода

Во время проведения методики могут быть допущены ошибки, которые приведут к получению неправильного результата:

  • неправильно настроенный прибор, допущение ошибки в его калибровке;
  • неверный расчет показателя с помощью формулы;
  • неверная дозировка раствора или крови, ошибка в подборе пипеток для взятия определенного количества жидкости;
  • стояние полученного образца чрезмерно продолжительное количество времени;
  • использование неправильных реагентов или истечения срока их годности;
  • использование высоких или низких температур во время исследования;
  • ошибка во время забора крови (работа кулаком, резкое перемещение пациента из лежачего состояние в положение сидя);
  • отсутствие добавления антикоагулянта, вследствие чего образуется сгусток и проведение анализа невозможно;
  • использование загрязненных приборов для хранения, перенесения, исследования биологической жидкости.

Для исключения ошибок в полученных данных врач должен назначать несколько анализов. Если результаты будут схожи, это говорит о правильности исследования. Ошибки могут быть не только в лаборатории, но и в неправильной подготовке пациента. Поэтому врач должен предупредить о необходимых действиях, которые он должен совершить до исследования. 

Гемихромный метод определения гемоглобина – исследование последнего поколения, которое предотвращает воздействие токсических веществ на организм врачей-лаборантов. Показатели, полученные с помощью методики достоверны. Определение количества гемоглобина помогает лечащему врачу в постановке диагноза, определении состояния пациента

Важно правильно подготовиться к исследованию, чтобы исключить риск ошибки. 

Читайте о том, какие методы определения гемоглобина в крови еще существуют.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

Полезное видео

Гликозилированный гемоглобин: подробнее о веществе и исследовании

Механизм образования HbA1c

Гликозилированный (гликированный) гемоглобин (гликогемоглобин, HbA1c) представляет собой результат долговременного взаимодействия глюкозы и гемоглобина эритроцитов. Его содержание в крови позволяет оценить, какова была средняя концентрация глюкозы в крови за последние два-три месяца. Она определяется по формуле:

Средняя концентрация глюкозы (ммоль/л) = Уровень (HbA1c*33,3 — 86)/18

Методы исследования уровня HbA1c

Уровень гликозилированного гемоглобина в крови в современных лабораториях чаще определяется при помощи катионообменной хроматографии высокого давления. Результат отражает процентное содержание гликогемоглобина во всем объеме гемоглобина. Для исследования необходима венозная кровь.

Правила подготовки к сдаче крови на анализ

Для исследования берут венозную кровь

При необходимости оценки уровня гликированного гемоглобина следует:

  • отказаться от приема пищи за 2-3 часа до сдачи биоматериала (разрешено пить негазированную воду);
  • ограничить уровень физической активности за полчаса до анализа;
  • постараться предупредить колебания эмоционального фона за полчаса до исследования.

О чем говорит теория?

Часть глюкозы, которая циркулирует в крови, спонтанным образом может связываться с гемоглобином. Результатом этого взаимодействия и является гликогемоглобин.

Реакция его образования необратима, то есть вещество остается в неизмененном состоянии до окончания жизни эритроцита. Если уровень глюкозы постоянно находится выше допустимых границ, то это отражается и на содержании гликозилированного гемоглобина в крови.

Образование гликогемоглобина происходит непрерывно, потому что часть эритроцитов гибнет, а “молодые”, гемоглобин в которых еще не гликирован, поступают в кровеносное русло.

Несоблюдение диеты не скроется от глаз врача

Анализ содержания гликированного гемоглобина в крови назначается пациентам для контроля эффективности регулирования концентрации глюкозы в процессе терапевтической коррекции сахарного диабета. Показатель позволяет оценить, правильно ли подобрано лечение, соблюдает ли пациент диету или есть основания в этом сомневаться.

В ряде случаев определение HbA1c целесообразно в ходе лабораторной диагностики манифестации диабета, а также преддиабетических состояний. В таких клинических ситуациях исследование назначается одновременно с анализом концентрации глюкозы в сыворотке крови натощак и тесту оценки толерантности к глюкозе.

Еще раз о целях исследования

Измерение гликогемоглобина рационально в следующих случаях:

  1. Долгосрочный контроль уровня глюкозы у пациентов с сахарным диабетом. Это необходимо для минимизации риска осложнений заболевания со стороны нервной, сердечно-сосудистой, выделительной систем.
  2. Подтверждение корректности и эффективности терапевтических мер, подобранных специалистом.
  3. Фиксация неконтролируемых скачков концентрации глюкозы в крови у пациентов, диабет у которых диагностирован недавно.
  4. Ранняя диагностика диабета и преддиабетических состояний.

Подозрительные симптомы

В последнем случае исследование требуется при обнаружении таких клинических проявлений:

  • полидипсия — усиленная жажда;
  • полиурия — частые и обильные мочеиспускания;
  • снижение остроты зрения;
  • утомляемость;
  • ухудшение работы иммунной системы, которое выражается в высокой восприимчивости к инфекционным заболеваниям.

Диагностически значимые диапазоны HbA1c

Характер зависимости содержания HbA1c от уровня глюкозы

Диапазон референсных значений гликозилированного гемоглобина — от 4,8 до 5,9%. У пациентов с преддиабетическими состояниями значение показателя может колебаться от 5,7 до 6,4%. Если уровень гликогемоглобина выше 6,5%, то это подтверждает диагноз “сахарный диабет”.

Что может повлиять на результат исследования?

Снижение уровня гликогемоглобина может наблюдаться в таких ситуациях:

  • патологии, при которых гемоглобин имеет аномальную форму (серповидно-клеточная анемия);
  • гемолитическая анемия, анемия после кровопотери и другие формы анемических состояний.

Повышение концентрации гликированного гемоглобина может быть спровоцировано недостатком железа, а также не так давно перенесенным переливанием крови.

Как проверить гемоглобин: методы определения гемоглобина

Фактически О2 в крови очень много, а клетки тканей его не получают, т.к. НвСО — прочное соединение с О2.

Метгемоглобин представляет собой более стойкое, чем оксигемоглобин, соединение гемоглобина с кислородом, получающееся при отравлениях некоторыми лекарственными препаратами — фенацетином, антипирином, сульфаниламидами. При этом двухвалентное железо простетической группы, окисляясь, превращается в трехвалентное. Метгемоглобин (MetНв) — окисленная форма Нв, крови придает коричневую окраску. Образуется MetНв при действии на Нв любым окислителями: нитраты, перекиси, перманганат калия, красная кровяная соль и т.д. Это стойкое соединение, потому что железо из ферроформы (Fe++) переходит в ферриформу (Fe+++), необратимо связывающую О2. При образовании в организме больших количеств MetНв также возникает кислородная недостаточность (гипоксия).

Сульфгемоглобин обнаруживается в крови иногда при применении лекарственных веществ (сульфаниламидов). Содержание сульфгемоглобина редко превышает 10%. Сульфгемоглобинемия — необратимый процесс. Так как пораженные эритроциты разрушаются в те же сроки, что и нормальные, явлений гемолиза не наблюдается и сульфгемоглобин может находиться в крови в течение нескольких месяцев. На этом свойстве сульфгемоглобина основан метод определения сроков пребывания нормальных эритроцитов в периферической крови.

Дата добавления: 2015-11-05; просмотров: 1126 | Нарушение авторских прав

Похожая информация:

  1. I. Значение владения движимыми вещами (бумагами на предъявителя и правами требования как вещами)
  2. III. Виды владения, защита и юридическое значение владения
  3. IV. Понятие, значение и функции страхования
  4. L-формы бактерий, их свойства. Значение L-форм в патологии человека
  5. MS OFFICE WORD. Основные сведения, назначение. Структура документа
  6. V. СОЦИАЛЬНАЯ СУЩНОСТЬ, НАЗНАЧЕНИЕ И ФУНКЦИИ МОРАЛИ
  7. YI. Конвенция о водно-болотных угодьях, имеющих международное значение, главным образом, в качестве местообитаний водоплавающих птиц
  8. А) Значение напряжения, силы тока и сопротивления
  9. А. 2 Н. Б. 0,5 Н. В. 8 Н. Г. Равнодействующая может иметь любое значение
  10. Абсолютное значение 1% прироста составило по региону «А» составил 2,4, по региону «Б» 2,5, а по региону «В» 14,3
  11. Абсолютное значение одного процента прироста
  12. Аварийные радиобуи EPIRB, SART. Назначение, использование, эксплуатационные проверки

Поиск на сайте:

Рейтинг автора
5
Материал подготовил
Максим Иванов
Наш эксперт
Написано статей
129
Ссылка на основную публикацию
Похожие публикации