Андрей Смирнов
Время чтения: ~8 мин.
Просмотров: 1

Метод окраски капсул по антони

Немного истории

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, «И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное.»         В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.

Результаты окраски

Грам(+) микроорганизмы окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, Грам(-), воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

К недостаткам этого метода окраски следует отнести определенные трудности при отнесении выявленных микроорганизмов к Грам(+) или Грам(-) по цвету из-за их неоднородного прокрашивания ввиду возможности присутствия в вагинальном мазке большого количества слизи и разнообразных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. В этой связи Мавзютов А. Р. и соавт. предложили использовать для микроскопической диагностики БВ окраску метиленовым синим .

Окраска метиленовым синим

Приготовление растворов:

Раствор «А»: 2,5 г кристаллического фиолетового растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 3-4 недели);

Раствор «Б»: 12,5 г натрия карбоната растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 2 нед., до выпадения кристаллов);

Раствор йода: 1 г натрия гидроксида растворить в 7 мл дистиллированной воды, затем добавить 5 г кристаллического йода и 0,25 к калия йодида, к полученному раствору добавить дробно 243 мл дистиллированной воды;

Смывная жидкость для обесцвечивания: 75 мл ацетона добавить к 175 мл этилового спирта;

Раствор сафранина: 5 г сафранина растворить в 15-20 мл этилового спирта и добавить до 250 мл дистиллированной воды.

Окраска мазков

1.Мазки фиксируют над пламенем горелки. На свободную от исследуемнго материала часть стекла одновременно наносят по 6 капель растворов «А» и «Б». Смешивают стеклянной палочкой и равномерно распределяют по стеклу. Экспозиция – 2 мин.

2.Удаляют остатки краски и наносят раствор йода на 2 мин.

3.Удаляют остатки йода и наносят 10-20 капель смывной жидкости, повторяют манипуляцию до полного обесцвечивания, постоянно покачивая стекло.

4.Промывают водопроводной водой.

5.Докрашивают сафранином 2 мин.

Промывают водой, просушивают, микроскопируют.

Результаты окраски

При использовании данной окраски происходит оптимальное прокрашивание препарата метиленовым синим грамположительной флоры в голубые тона и грамотрицательной — в интенсивный иссиня-черный цвет.

Непосредственную микроскопию лучше проводить под относительно небольшим увеличением (окуляр х 2-7) с целью увеличения поля зрения и максимального охвата всех присутствующих в материале объектов.

С учетом современных достижений клинической бактериологии и знаний инфекционной патологии женских половых органов Кира Е. Ф. в 1994 году была разработана оригинальная классификация микроскопической характеристики биоценоза влагалища, в которой представлена микроскопическая характеристика 4 типов биоценоза влагалища и соответствующие каждому типу нозологические формы:

Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену

Метод
Грама.

Относится к сложным методам окраски и
позволяет дифференцировать грамположительные
и грамотрицательные бактерии, что
является важным таксономическим
признаком. Результат окраски определяется
особенностями строения клеточной стенки
бактерий. При окраске генцианвиолетом
и последующем воздействии раствора
Люголя образуется комплексное соединение
генцианвиолета и йода с пептидогликаном,
которое при дифференциации спиртом
удерживается в клетках грамположительных
бактерий, имеющий многослойный
пептидогликан и вымывается из
грамотрицательных бактерий, имеющих
тонкий слой пептидогликана. При
дополнительной окраске водным раствором
фуксина грамотрицательные бактерии
приобретают красный цвет.

Таблица
4. Метод Грама

Этапы окраски

Цвет
бактерий

  1. На
    фиксированный мазок поместить
    фильтровальную бумажку, пропитанную
    генцианвиолетом, смочить водой, 2-3
    минуты

Все
бактерии окрашиваются в фиолетовый
цвет

  1. Снять
    бумажку, слить с препарата оставшуюся
    краску и налить раствор Люголя на 1
    минуту

Все
бактерии остаются фиолетовыми

  1. Для
    дифференцирования нанести на мазок
    этиловый спирт и обесцветить в течение
    30-60 с, промыть водой

Грамположительные
бактерии остаются фиолетовыми,
грамотрицательные обесцвечиваются

  1. Нанести
    фуксин Пффейфера (водный раствор
    фуксина) и докрасить 1-2 мин, промыть
    водой, высушить

Грамположительные
остаются фиолетовыми, грамотрицательные
окрашиваются в красный цвет

Метод
Циля-Нильсена.
Относится
к сложным методам окраски и позволяет
дифференцировать кислотоустойчивые и
некислотоустойчивые бактерии.

Таблица
5. Метод Циля-Нильсена

Этапы окраски

Цвет
бактерий

  1. На
    фиксированный мазок нанести карболовый
    раствор фуксина Циля через полоску
    фильтровальной бумаги и подогреть
    препарат в пламени горелки до появления
    паров (повторить 3-4 раза)

Все
бактерии окрашиваются в красный цвет

  1. Снять
    бумагу, промыть мазок водой

Все
бактерии остаются красными

  1. Для
    дифференцирования нанести 5% раствор
    серной кислоты на 1-2 минуты

Кислотоустойчивые
бактерии остаются красными,
некислотоустойчивые обесцвечиваются

  1. Нанести
    водный раствор метиленового синего
    и докрасить 3-5 мин, промыть водой,
    высушить

Кислотоустойчивые
остаются красными, некислотоустойчивые
окрашиваются в синий цвет

Кислотоустойчивые
бактерии имеют особое строение клеточной
стенки, содержащей большое количество
сложных липидов (миколовых кислот,
восков, глико- и фосфолипидов), что делает
эти бактерии кислото-, щелоче- и
спиртоустойчивыми. Клеточная стенка
этих бактерий плохо воспринимает
анилиновые красители и обычные способы
окраски. Высокая температура в процессе
окраски методом Циля-Нильсена расплавляет
липиды, фенол разрыхляет клеточную
стенку и краситель проникает внутрь
клетки. После остывания препарата липиды
вновь затвердевают, прочно удерживая
краситель, поэтому кислотоустойчивые
бактерии не обесцвечиваются серной
кислотой и остаются красными.
Некислотоустойчивые бактерии
обесцвечиваются и их докрашивают
контрастным красителем – метиленовым
синим. В основном, метод используется
для окраски бактерий, относящихся к
роду Mycobacterium(M.leprae,
M.tuberculosis,
M,bovisи
др.)

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Кроме того, капсулы мягкие и непрочные, при окраске они могут потерять форму. Красящие вещества плохо взаимодействуют с желеобразной структурой капсул и легко вымываются при обработке. Чтобы обнаружить, но не повредить капсулы, пригодится негативный способ окрашивания.

Одним из способов выявления капсул является метод окрашивания по Гинсу. Каплю черной туши наносят на край предметного стекла, вносят в нее исследуемый материал, перемешивают и распределяют по всей поверхности. Мазок сушат на воздухе, фиксируют и окрашивают фуксином Циля. Через 2-3 минуты промывают водой и высушивают. В результате под микроскопом на общем темном фоне отчетливо просматриваются розовые клетки, окруженные прозрачными капсулами.

Естественная окраска колоний микроорганизмов

Существует целая группа микроорганизмов, называемая хромогенными бактериями, колонии которых как в природе, так и на искусственных средах окрашены ярко и разнообразно. Цветовая гамма представлена от нежно-лимонного до густого темно-синего и даже черного. Хромогенных бактерий множество – это и кокки, и палочки, и спириллы. Химический состав красителей тоже очень разнообразен.

Независимо от цвета колонии все хромогенные бактерии совершенно бесцветны, окраску обеспечивают капельки, кристаллики или зернышки, расположенные вне клеток и являющиеся отходами жизнедеятельности бактерий. Эти отходы могут растворяться и диффундировать в окружающую среду, что приводит к окрашиванию пространства колонии.

Неоднократно были предприняты попытки классификации хромогенных бактерий, однако успешных предложено не было.

Сегодня применяется классификация, основанная на растворимости пигмента:

  • пигмент водорастворим;
  • пигмент не растворяется в воде, но растворяется в спирте;
  • нерастворимый ни в воде, ни в спирте пигмент.

Данная классификация несовершенна, что объясняется недостатком информации как по природе пигмента, так и по самой функции хромогенеза.

Хромогенных бактерий известно уже очень много, а сортов красителей, которые они производят, намного меньше. Это объясняется тем, что различные хромогенные бактерии производят один и тот же пигмент.

Все бактериальные пигменты делят на 3 большие группы:

  • липохромы;
  • продигиозин;
  • бактериофлуоресцин.

Липохромы

Колонии, выделяющие липохромы, окрашены в цвета от желтого до красного. К ним относятся почти все кокки и в меньшей степени палочки.

Физико-химические свойства пигмента:

  • агрегатная форма – кристаллики;
  • нерастворим в воде;
  • растворим в органических растворителях (спирт, бензин, эфир, сероуглерод и др.);
  • омыляется горячей щелочью;
  • с концентрированной серной кислотой дает синее окрашивание – липоциановая реакция Цопфа. 

Продигиозин

Бактерии, выделяющие красный пигмент продигиозин, известны с давних времен как бактерии «чудесной крови».

О них упоминал Пифагор, запрещая своим ученикам есть вареные бобы, которые простояли ночь – на них могла появиться «кровь». В Средние века замечали появление «чудесной крови» на продуктах, когда сначала появляются небольшие кровавые капельки, которые очень быстро растут и прямо заливают продукты кровавым слоем.

Появление «чудесной крови» отмечалось на богатых крахмалом продуктах – хлебе, рисе, поленте, вареном картофеле, бывает на мясе или отварных яйцах, но достаточно редко. Может развиться на молоке, тогда слой сливок окрашивается в красный цвет, а само молоко быстро створаживается.

Бактерии «чудесной крови» не являются патогенными, однако некоторые продукты их жизнедеятельности – токсальбумины – обладают токсическими свойствами.

Физико-химические свойства пигмента:

  • жидкость;
  • малорастворим в воде;
  • растворяется в органических растворителях (спирты, эфир, хлороформ, сероуглерод и другие);
  • при взаимодействии со щелочами образуется оранжево-желтая краска;
  • при воздействии кислот образуется карминовая и далее – фиолетовая краска;
  • солнечный цвет разрушает пигмент в растворах.

Бактериофлуоресцин

Флуоресцирующий пигмент вырабатывают маленькие бактерии-палочки, подвижные за счет жгутика на одном конце, все они не образуют спор.

Физико-химические свойства пигмента:

  • в чистом виде не выделен, предположительно является белковым веществом;
  • водорастворим;
  • не растворяется в спиртах, эфирах и бензине;
  • концентрированный раствор имеет бледно-желтый цвет и флуоресцирует голубым цветом;
  • обработка щелочью сдвигает флуоресценцию в зеленый цвет;
  • при добавлении кислоты флуоресценция прекращается.

Кроме трех основных пигментов, были выделены пиоцианин (синий), пиоксантин (красно-бурый), синцианеин (синий) и другие.

Одни бактерии образуют пигмент всегда, другие микроорганизмы выделяют пигмент иногда. Есть бактерии, которые всегда выделяют только один пигмент, а есть бактерии, выделяющие несколько различных пигментов.

Хромобактерии изучены недостаточно хорошо, не выявлены причины, от которых зависит потеря хромобактериями способности выделять пигмент. Такие колонии называют лейкорасой. Однако при дальнейших посевах лейкораса может дать нормальное окрашивающее потомство.

Изучение способности бактерий к хромогенезу представляет большое не только научное, но и практическое значение.

Рейтинг автора
5
Материал подготовил
Максим Иванов
Наш эксперт
Написано статей
129
Ссылка на основную публикацию
Похожие публикации