Андрей Смирнов
Время чтения: ~8 мин.
Просмотров: 1

Окрашивание по граму: методика и теоретическое объяснение

Цель анализа

Регулярная сдача мазка способствует ранней диагностике болезней, которые передаются половым путем. Взятие мазка происходит на каждом приеме гинеколога.

Процедура безболезненная, но её пользу сложно переоценить.

Особенно важно сдавать мазок в следующих случаях:

  • при неприятных симптомах (зуд, жжение, изменение выделений);
  • прием препаратов на основе гормонов;
  • беременность или период лактации;
  • контроль в рамках лечения;
  • подготовка к диагностическим процедурам или операции.

Плохой результат мазка свидетельствует о заболеваниях.

Во время проведения некоторых процедур их присутствие нежелательно. Например, при проверке маточных труб контрастный раствор может разнести инфекцию по всей области малого таза. Это усложнит течение имеющегося заболевания.

Работа с фиксированными препаратами

По сложности работы методы окраски фиксированных (неживых) клеток разделяются на:

  1. Простые методы. В этом случае используют только одну краску, как правило, красную (фуксин) или синюю (метиленовый синий). Разница между этими красителями состоит в скорости воздействия. Фуксин дает результат уже через 1-2 мин., тогда как результат работы синей краски нужно ждать 3-5 мин. Использовать раствор фуксина в карболовой кислоте (т. н. фуксин Циля) удобно еще и потому, что приготовленный препарат в течение нескольких месяцев не теряет окрашивающих свойств. Метиленовый синий краситель тоже может быть подготовлен заранее в крепком спиртовом растворе.
  2. Сложные (дифференциальные) методы. Здесь потребуется несколько красителей (минимум два), имеющих различный цвет. Это позволит не просто увидеть бактерии, но и подробнее изучить их внутреннее строение, так как различные участки клетки могут по-разному воспринимать красители. К сложным относят методы Грама, Циля – Нильсена (для кислотоустойчивых бактерий), Бениньетти (окраска бактериальных жгутиков), Гинса (выявление капсул), дифференцирующий метод Романовского – Гимзы (окраска спор) и некоторые другие.

Дифференцирующий способ Романовского – Гимзы основан на применении специального готового порошка, на основе которого лаборатории готовят раствор красителя нужной концентрации. Преимущество этого способа в том, что цитоплазма и ядро клетки получают различную окраску, что облегчает идентификацию и изучение микроорганизмов.

Метод Нейссера используют в медицине для обнаружения зерен волютина (гранул с запасом пищи для многих прокариотических клеток) у возбудителей дифтерии. В результате окрашивания бактерия приобретает желтый цвет, а гранулы волютина – синий.

Справочная информация

ДокументыЗаконыИзвещенияУтверждения документовДоговораЗапросы предложенийТехнические заданияПланы развитияДокументоведениеАналитикаМероприятияКонкурсыИтогиАдминистрации городовПриказыКонтрактыВыполнение работПротоколы рассмотрения заявокАукционыПроектыПротоколыБюджетные организацииМуниципалитетыРайоныОбразованияПрограммыОтчетыпо упоминаниямДокументная базаЦенные бумагиПоложенияФинансовые документыПостановленияРубрикатор по темамФинансыгорода Российской Федерациирегионыпо точным датамРегламентыТерминыНаучная терминологияФинансоваяЭкономическаяВремяДаты2015 год2016 годДокументы в финансовой сферев инвестиционной

Мазок отпечаток: что делать, если результаты плохие

Если результаты мазка отпечатка оказались плохими, в первую очередь пациент не должен впадать в панику. Необходимо, посетив врача, получить от него направление на повторный анализ. При положительных результатах необходимо обязательно перепроверять итоги.

Чтобы исключить ложноположительные варианты поставки диагноза. Далее, после того как будут получены повторные результаты, если они все еще положительны, нужно обратиться к врачу.

Медицинский работник сможет:

  • дать рекомендации относительно прохождения дополнительных исследований, чтобы поставить окончательный диагноз;
  • дать рекомендации относительно правильного лечения заболевания;
  • проконтролировать ход терапии и назначить контрольную диагностику, чтобы понять, насколько в итоге эффективно лечение;
  • при необходимости поменять подход к лечению, чтобы получить надежные результаты.

Если у пациента выявлены инфекции, передающиеся половым путем, это может грозить нарушением репродуктивной функции. Именно бесплодие в основном заставляет людей обращаться к врачу для проведения диагностики. В которую, в том числе, может входить и выполнение мазка отпечатка.

Часто пациенты интересуются, где можно сдать цитологию мазка отпечатка или пройти альтернативу этому исследованию. Обратиться можно как в государственный кожно-венерологический диспансер, так и в частную клинику при необходимости. Сдать биоматериал на исследование можно на бесплатной основе. Если проходить диагностику по месту жительства по рекомендации врача. Также и платно.

Сдача мазка отпечатка – это хороший диагностический метод, позволяющий поставить диагноз во многих случаях. Если же этого подхода будет недостаточно для определения болезни, врач сможет после оценки результатов подобрать наиболее оптимальные варианты уточняющей диагностики. А затем выбрать способы терапии, которые дадут положительный эффект, а также проконтролировать ход лечения.

При необходимости сделать мазок отпечаток обращайтесь к грамотным венерологам и гинекологам.

Техника проведения окрашивания

Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др. Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.

Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.

Подготовка материала для окраски

Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация

При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).

Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

  1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Чтобы избежать осадка красят через фильтровальную бумагу.
  2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором, по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) в почернение препарата.
  3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96 ° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок НЕ обесцветится и жидкость стекает, не станет чистой (примерно 20-40-60 секунд).
  4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
  5. Для выявления грамотрицательных бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранина (2-5 мин).
  6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Окраска мазков по Wright-Giemsa (№ 9990710)

На основе эозинатов полихромного метиленового синего

1. Погрузить предметные стекла в раствор красителя Райт-Гимза на выбранное время (примерно 60 секунд). Не взбалтывать краситель!

2. Осушить или промокнуть свободную часть предметного стекла (или стеклодержатель), чтобы удалить избы ток краски.

3. Погрузить предметное стекло в буферный раствор примерно на то же самое время, что и время в красителе (60 секунд). Увеличение или уменьшение времени пребывания мазка в краске или буфере будет менять окончательный цвет препарата.

4. Осушить или промокнуть свободную часть препарата (или стеклодержатель), чтобы удалить избыток бу фера.

5. Погрузить мазок в раствор очистителя на 2-10 секунд, быстро взбалтывая.

6. Протереть обратную сторону стекла.

7. Высушить окрашенный мазок в вертикальном положении, поставив на адсорбирующую поверхность (напри мер, на фильтровальную бумагу). Не промокать мазок!

8. Нанести каплю масла и исследовать мазок под микроскопом. Результаты: как при окрашивании по Романовскому.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР — метод, в основу которого положен процесс естественной репликации ДНК, осуществляемый в клетках.

ПЦР позволяет обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК среди большого количества других молекул вирусного и клеточного происхождения.

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

— ДНК-мишени (ДНК, которую необходимо амплифицировать).

— Праймеров — пар олигонуклеотидов, протяженностью от 15 до 30 нуклеотидных пар (нп), комплементарных к соответствующим участкам ДНК-мишени. Корректно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

— Taq- полимеразы — термостабильного фермента, достраивающего вторую цепь ДНК по одному из тяжей ДНК-мишени.

— Дезоксинуклиотидтрифосфатов дНТФ — дезоксиаденозинтрифосфат дАТФ, дезоксигуанозинтрифосфат дГТФ, дезоксицитозинтрифосфат дЦТФ и дезокситимидинтрифосфат дТТФ. Эти компоненты используются Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

— Буферного раствора (БР), обеспечивающего оптимальные условия для реакции.

ПЦР включает в себя три температурных этапа:

— Первый этап состоит из процесса денатурации ДНК, находящихся в образце, в результате денатурации одна двухцепочечная молекула ДНК переходит в две одноцепочечные молекулы. Температурный режим ТР — 92-95 °С.

— Второй этап заключается в гибридизации (присоединении) праймеров к комплементарным участкам ДНК-мишени; этот процесс носит название отжига праймеров. ТР — 55-60 °С.

— Третий этап ПЦР включает в себя синтез второй цепи на одноцепочечной молекуле ДНК-мишени, на которой произошел отжиг праймеров. ТР на этом этапе соответствует оптимальным условиям работы Taq-полимеразы и равен примерно 70-74 °С.

Если трехэтапный температурный цикл многократно повторить (30—40 циклов), то количество амплифицированных молекул ДНК-мишени (ампликонов) достигнет приблизительно 2 (где п число циклов амплификации). Необходимо отметить, что процесс накопления продуктов амплификации идет по геометрической прогрессии лишь определенное число циклов, а затем имеет место эффект «плато», то есть количество ампликонов не возрастает.

Детекцию ампликонов выполняют методами электрофореза или с помощью ДНК-ИФА. В настоящее время на рынке существует система DASH, которая позволяет выявлять ампликоны, используя совершенную систему ДНК-ИФА (дополнительная информация по запросу).

Организация ПЦР лаборатории требует специального оборудования (ламинары, настольные центрифуги, термостаты, пипетманы и т. д.) и специально оборудованных и корректно расположенных помещений (для предупреждения контаминации).

Метод in situ RT-PCR был разработан с целью соединения высокой чувствительности метода реакции об ратно — транскриптазной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) с преимуществами исследований in situ, что особенно важно, например, для вирусов с низким уровнем репликации. Как и ISH. in situ RT-PCR состоит из нескольких этапов: подготовка биологического материала, in situ амплификация, обнаружение внутриклеточньи продуктов RT-PCR. In situ RT-PCR. Необходимое оборудование: термоциклер PCR Express (№-HB-PX-B05) со сменным блоком для предметных стекол или самостоятельный прибор Omnislide (№ HB-OS-BB-220), который позволяет целиком решить технологиче кие задачи приготовления образцов

Необходимое оборудование: термоциклер PCR Express (№-HB-PX-B05) со сменным блоком для предметных стекол или самостоятельный прибор Omnislide (№ HB-OS-BB-220), который позволяет целиком решить технологиче кие задачи приготовления образцов.

По вопросам обучения современным методам в клинической цитоморфологии просим обращаться в учебный центр фирмы «ЛабМетод».

Рейтинг автора
5
Материал подготовил
Максим Иванов
Наш эксперт
Написано статей
129
Ссылка на основную публикацию
Похожие публикации