Андрей Смирнов
Время чтения: ~10 мин.
Просмотров: 1

Окраска микроорганизмов

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Как оказалось, клетки покрыты оболочкой, похожей на переплетенные между собой нити. И хотя в просветы между нитями свободно проходят питательные вещества, необходимые клетке, оболочка надежно защищает «внутренний мир» от внешних агрессивных факторов. У разных видов бактерий наружная стенка клетки имеет различную толщину, плотность и химический состав. Именно на этом свойстве клеточных оболочек базируется метод окраски по Граму.

Отталкиваясь от работ Кристиана Грама, биологи разработали новые методы, позволяющие не только определить форму и размер клеток, но и рассмотреть некоторые подробности их строения. Иногда микроорганизмы, совершенно идентичные по внешнему виду, по-разному реагируют на красители. Полученная информация дает возможность быстро и точно определить вид бактерий.

Занятие 6 Питательные среды. Техника посева микробов Культивирование и рост микроорганизмов

Компетенции
обучающегося, формируемые в результате
освоения занятия:

ОК-7 Способен получать и обрабатывать
информацию из различных источников,
готов интерпретировать, структурировать
и оформлять её в доступном для других
виде;

ПК-7
Умеет использовать технические средства
для измерения основных параметров
технологических процессов, свойств
сырья, полуфабрикатов и качество готовой
продукции, организовывать и осуществлять
технологический процесс производства
продукции питания;

ПК-30
Умеет проводить
исследования по заданной методике и
анализировать результаты экспериментов.

Цель
занятия

ознакомить студентов с рецептами и
методиками приготовления питательных
сред, с методами
культивирования микроорганизмов.
Освоить технику
посева микроорганизмов на плотные и
жидкие питательные среды.

Формирование:

Знание:
требований,
предъявляемых к питательным средам,
классификацию питательных сред, методов
культивирования микроорганизмов и фаз
роста микроорганизмов

Умение:
приготовить
питательные среды, применять
методы культивирования

Владение:
техникой
посевов микроорганизмов на питательные
среды, методами
культивирования микроорганизмов

Материалы
и оборудование

колбы, воронки, марля, гигроскопическая
вата, пробирки с ватными пробками,
градуированные пипетки различной
емкости, электроплитка, набор полуфабрикатов
питательных сред, весы, чашки Петри,
пробирки, бактериологические петли,
стеклянные шпатели, анаэростат,
эксикатор, термостат,стерильные
пипетки Пастера, презентации,
плакаты.

Содержание
и методика работы

Способ Ольта

Мазок
окрашивают 2—3% водным раствором сафранина
в течение 1—3 минут с последующим быстрым
смыванием водой. Раствор сафранина
готовят перед употреблением, растворяя
краску в горячей воде с последующим
фильтрованием. На мазок наносят каплю
воды, накрывают по­кровным стеклом,
а на него помещают каплю иммерсионной
жидкости. Благо­даря прохождению
световых лучей через слой воды усиливается
разница в лучепреломлении капсулы и
тела бактерии; под микроскопом отчетливо
видны окрашенные капсулы.

Микроскопическая
картина: капсулы — бледно-желтого, а
бактерии —коричневого цвета.

Нуклеоид

Нуклеоид
– ядерный аппарат бактерий. Представлен
молекулой ДНК, соответствующей одной
хромосоме. Она циркулярно замкнута,
располагается в ядерной вакуоле, не
имеет ограничивающей от цитоплазмы
мембраны и митотического аппарата.

С ДНК
связано небольшое количество РНК и
РНК-полимеразы. ДНК свернуто вокруг
центрального стержня, состоящего из
РНК и представляет собой высокоупорядоченную
компактную структуру. Хромосомы
большинства прокариот имеют молекулярную
массу в пределах 1-3х109, константу
седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК
включает 1,6х107нуклеотидных пар.
Различия в генетическом аппарате
прокариотных и эукариотных клеток
обуславливает его название: у первых –
нуклеоид (образование подобное ядру),
в отличие от ядра у вторых.

В
нуклеоиде бактерий содержится основная
наследственная информация, которая
реализуется в синтезе специфических
белковых молекул. С ДНК бактериальной
клетки связаны системы репликации,
репарации, транскрипции и трансляции.

Нуклеоид
в прокариотной клетке может быть выявлен
в окрашенных препаратах с помощью
светового или фазово-контрастного
микроскопа. Для окрашивания ядерного
вещества используется краситель
Фельгена, который специфически окрашивает
ДНК.

Метод окраски ДНК по
Фельгену

  1. Мазок из культуры
    бактерий фиксируют 2-3 мин метиловым
    спиртом и помещают в холодную 1% HCl на 1
    мин.

  2. Подвергают
    гидролизу при 60С в 1% HCl 5-10 мин и
    споласкивают дистиллированной водой.

  3. Помещают мазок в
    реактив Шиффа на 40-60 мин, промывают в
    водопроводной воде 2 мин.

В
результате взаимодействия свободных
альдегидных групп с бесцветной
фуксинсернистой кислотой появляется
фиолетовая окраска, свойственная
основному фуксину.

У многих
бактерий в цитоплазме обнаружены
внехромосомные генетические элементы
– плазмиды. Они представляют собой
замкнутые в кольца двухцепочечные ДНК,
состоящие из 1500-40 000 пар нуклеотидов и
содержащие до 100 генов.

Плазмиды
могут существовать в клетке и в
интегрированном состоянии с бактериальной
хромосомой, сохраняя при этом способность
переходить к автономии.

1Г. Тестовые вопросы по теме занятия

Микроскопический
метод диагностики:

-обнаружение
микроба-возбудителя в патологическом
материале с помощью микроскопии

выделение
микроба-возбудителя из патологического
материала в чистой культуре и его
идентификация

заражение
патологическим материалом лабораторного
животного

обнаружение
специфических антител или микробных
антигенов

Культуральный
метод диагностики:

обнаружение
микроба-возбудителя в патологическом
материале с помощью микроскопии

-выделение
микроба-возбудителя из патологического
материала в чистой культуре и его
идентификация

заражение
патологическим материалом лабораторного
животного

обнаружение
специфических антител или микробных
антигенов

Биологический
метод диагностики:

обнаружение
микроба-возбудителя в патологическом
материале с помощью микроскопии

выделение
микроба-возбудителя из патологического
материала в чистой культуре и его
идентификация

-заражение
патологическим материалом лабораторного
животного

обнаружение
специфических антител или микробных
антигенов

Иммунологический
метод диагностики:

обнаружение
микроба-возбудителя в патологическом
материале с помощью микроскопии

выделение
микроба-возбудителя из патологического
материала в чистой культуре и его
идентификация

заражение
патологическим материалом лабораторного
животного

-обнаружение
специфических антител или микробных
антигенов

Описательный
период развития микробиологии:

-изобретен
микроскоп и открыты микроорганизмы

разработаны
методы культивирования микроорганизмов
и открыты первые возбудители микробных
заболеваний человека

открыт
иммунитет

разработаны
молекулярные методы исследования

Физиологический
период развития микробиологии:

изобретен
микроскоп и открыты микроорганизмы

-разработаны
методы культивирования микроорганизмов
и открыты первые возбудители микробных
заболеваний человека

открыт
иммунитет

разработаны
молекулярные методы исследования

Иммунологический
период развития микробиологии:

изобретен
микроскоп и открыты микроорганизмы

разработаны
методы культивирования микроорганизмов
и открыты первые возбудители микробных
заболеваний человека

-открыт
иммунитет

разработаны
молекулярные методы исследования

Современный
период развития микробиологии:

изобретен
микроскоп и открыты микроорганизмы

разработаны
методы культивирования микроорганизмов
и открыты первые возбудители микробных
заболеваний человека

открыт
иммунитет

-разработаны
молекулярные методы исследования

Пастеровский
период развития микробиологии:

описательный
период развития микробиологии

-физиологический
период развития микробиологии

иммунологический
период развития микробиологии

современный
период развития микробиологии

Пастером
открыты:

-стафилококк

-пневмококк

-клостридии

палочка
сибирской язвы

холерный
вибрион

туберкулёзная
палочка

Кохом
открыты:

стафилококк

пневмококк

клостридии

-палочка
сибирской язвы

-холерный
вибрион

-туберкулёзная
палочка

Пастер:

-разработал
первые живые вакцины

-разработал
метод стерилизации пищевых продуктов
– пастеризацию

ввёл
использование плотных питательных сред

первым
стал использовать методы окраски мазков

оснастил
микроскоп иммерсионным объективом

Кох:

разработал
первые живые вакцины

разработал
метод стерилизации пищевых продуктов
– пастеризацию

-ввёл
использование плотных питательных сред

-первым
стал использовать методы окраски мазков

-оснастил
микроскоп иммерсионным объективом

Учёный,
с чьим именем связано становление
микробиологической науки в Беларуси:

Жилибер

-Эльберт

Вотяков

Основоположник
белорусской вирусологии:

Жилибер

Эльберт

-Вотяков

В
один таксон объединяет объекты, имеющие
общий корень происхождения:

-филогенетическая
систематика

практическая
систематика

В
один таксон объединяет объекты, схожие
по своим признакам:

филогенетическая
систематика

-практическая
систематика

Основная
таксономическая единица в бактериологии:

вариант

штамм

клон

-вид

род

семейство

порядок

Подвидовые
категории в таксономии микрооорганизмов:

-вариант

-штамм

-клон

вид

род

семейство

порядок

Основная
таксономическая единица в вирусологии:

вариант

штамм

клон

вид

-род

семейство

порядок

Какой
вид микроскопии наиболее часто
используется в бактериологии:

электронная

обычная
световая

-иммерсионная

тёмнопольная

фазово-контрастная

люминесцентная

Простые
методы окраски мазков:

-метиленовым
синим

-водным
фуксином

по
Граму

по
Цилю-Нильсену

по
Нейссеру

по
Бурри-Гинсу

Сложные
методы окраски мазков:

метиленовым
синим

водным
фуксином

-по
Граму

-по
Цилю-Нильсену

-по
Нейссеру

-по
Бурри-Гинсу

Дифференциально-диагностические методы окраски микробов. Окраска по Граму, механизм и техника окраски.

Сложные методы. Включают последовательное
нане­сение на препарат красителей,
различающихся по химическому

составу и цвету, протрав и дифференцирующих
веществ. Это позволяет выявить определенные
структуры клеток и дифференцировать
одни виды микроорганизмов от других.

1. По
Леффлеру
— гранулы
валютина окрашиваются в темно- синий,
а палочка дифтерийной каринобактерии
в голубой.

2. По
Нейсеру
— валютин в
сине-черный, а бактерия в желтый.

3. По
Гинсу-Бурри
— обнаружение
капсул

4. По
Шефферу
— Фультону-
окрашивание спор ( существует еще способ
Пешкова).

5. Окраска
по Цилю- Нельсену
.
Применяется для выявления кислото- и
спиртоустойчивых микобактерий
туберкулеза, лепры и некоторых
актиномицетов, которые из-за большого
количества в клеточных оболочках
липилов, воска и оксикислот непроницаемы
дл: разведенных растворов красителей.
Окрашивание их достигается, при помощи
фенолового фуксина Циля с подогреванием
над пламенем горелки до закипания и
отхождения паров. Окрашенные с применением
термокислотной обработки кислотоустойчивые
бактерии не обесцвечиваются слабыми
растворами минеральных кислот и спирта.Кислоустойчивые бактерии
окрашиваются в интенсивно красный цвет,
остальные виды микробов, обесцвечивающиеся
в процессе обработки препарата кислотой,
— в светло-синий цвет.

6. Окраска
по Романовскому-Гимзе

Осуществляется сложным красителем (в
его состав входят метиленовый синий,
эозин и азур), в результате он окрашивает
бактерии (спирохеты), простейшие и
форменные -элементы крови в различные
цвета и оттенки. Так, под его воздействием
цитоплазма простейших приобретает
голубой цвет, а ядра — красный: боррелии
окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а
трепонемы и лептоспиры — в слабо-розовый;
эритроциты — в розовый цвет, ядра
лейкоцитов — в фиолетовый, а их цитоплазма
— в голубой (базофильная зернистость —
в синий, эозинофильная — н красный,
нейтрофильная — в сиреневый).

7. Окраска
по Граму.

Из-за неодинакового содержания
пептидогликана (ПГ) в оболочках разных
прокариот метод дает возможность
подразделять их на грамположительные
(фиолетовые, 90 % ПГ)
и грамотрицательные (розовые, 5-20 % ПГ) В
соответствии с этим, во-первых, в царстве
прокариот выделяют четыре раздела: 1.
тонкостенные, грамотрицательные. 2.
толстостенные, грамположительные. 3.
лишенные стенок. 4. дефектные стенки,
отсутствие пептидогликана. Во-вторых,
окраска по Граму позволяет также
установить родовую и видовую принадлежность
многих возбудителей инфекционных
болезней. Например, известно, что все
болезнетворные кокки (кроме гонококка
и менингококка), бациллы и клостридии
являются грамположительными. а
энтеробактерии, вибрионы, трепонемы —
грамотрицательными.

Техника окраски по Граму:

    1. Наносим на фиксированный
      мазок через фильтровальную бумажку
      раствор генцианвиолетта на 2-3 минуты.
      У грам+ м/о генцианвиолет проникает
      вглубь клеточной стенки и образует
      прочный комплекс с трихоевыми кислотами
      и Mgниевыми
      солями РНК, у грам- краситель проникает
      в в клеточную стенку.

    2. Промываем водой – для удаления излишков
      красителя

    3. Наносим раствор Люголя на
      1 минуту – для удаления остатков влаги
      и укрепления образовавшейся связи у
      грам+.

    4. Сливаем, не промывая водой.

    5. Наносим раствор этилового 96% спирта
      на 30 секунд, равномерно покачиваем для
      отхождения фиолетовых пятен. Из грам-
      вымывается краситель.

    6. Промыть под водой

    7. Наносим раствор фуксина на 2-3 минуты
      для окраски обесцветившихся грам- м/о

    8. Промыть водой

->
грам- — красные, грам+ — синие.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

При подготовке микроорганизмов к исследованию бактериальную культуру несколько раз пересеивают на свежую питательную среду в течение нескольких дней. Затем бактерии со жгутиками переносят в пробирку со стерильной водой (t 37⁰С)

Делают это предельно осторожно, не перемешивая жидкость, чтобы не повредить жгутики

Содержимое пробирки оставляют примерно на час, чтобы бактерии равномерно распределились по всему объему. Перед началом исследования проверяют подвижность клеток в висячей капле. Если движения нет, пробирку оставляют еще на некоторое время.

При нанесении раствора на предметное стекло клетки могут легко потерять жгутики. Поэтому поверхность стекла должна быть идеально чистой и обезжиренной. Перед нанесением капель раствора предметное стекло проводят над горячей частью пламени горелки, чтобы попавшие на поверхность капли расплылись и быстро высохли.

После высыхания мазок протравливают, через 15 минут химикат смывают. Следующий этап – окраску фуксином – проводят, погружая стекло в раствор красителя, чтобы не повредить жгутики при нанесении краски.

Выдержав нужное время, мазок промывают водой и высушивают. Теперь можно переходить к исследованию получившегося результата.

3.3.1.1. Оборудование и реактивы для окраски по методу Zieh-Neelsen

Для окраски мазков по методу Ziehl-Neelsen
необходимы:

— Раковина или специальный вместительный
лоток для проведения окраски;

— Специальный штатив («рельсы») для
окраски мазков на предметных стеклах;

— Пинцет или щипцы для взятия предметных
стекол с мазками;

— Газовая или спиртовая горелка для
фиксации препарата (если мазки не
фиксированы в сушильном шкафу) и
подогревания его при окрашивании
карболовым фуксином; или

— Металлический стержень с ватным
тампоном, который используется вместо
горелки для подогревания препарата при
окрашивании карболовым фуксином;

— Фильтровальная бумага размером ~ 4 х
1,5 см. для окраски мазков карболовым
фуксином;

— Раствор карболового фуксина;

— 25% раствор серной кислоты или

— 3% раствор солянокислого спирта;

— Дистиллированная вода для промывания
мазков;

— 0,3% раствор хлорида метиленового синего;

— Штатив для просушивания окрашенных
стекол на воздухе в вертикальном или
наклонном положении.

Реактивы:

— Спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ
6-09-4512-77;

— Кислота соляная концентрированная,
ГОСТ 3118-77;

— Кислота серная концентрированная,
ГОСТ 4204-77;

— Фенол кристаллический, ГОСТ 6417-72;

— Фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;

— Метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

— Глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;

— Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

Рейтинг автора
5
Материал подготовил
Максим Иванов
Наш эксперт
Написано статей
129
Ссылка на основную публикацию
Похожие публикации