Мазок-отпечаток

4.2. Приготовление мазков

На практике используются 2 метода приготовления мазков:

– метод прямой микроскопии, когда мазок готовится непосредственно из необработанного диагностического материала или его осадка, если материал жидкий;

– метод микроскопии мазка из осадка материала, подготовленного для культурального исследования после разжижения, деконтаминации, концентрирования и ресуспендирования осадка.

Процедура приготовления мазка начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только одноразовые новые отмытые, обезжиренные (в спирте или смеси Никифорова (96° этиловый спирт + эфир в соотношении 1:1)) стекла без царапин и сколов.

Стекло подписывают простым карандашом по матовой полосе либо алмазным карандашом по стеклу. Номер, проставленный на стекле, должен соответствовать номеру исследования в лабораторном регистрационном журнале.

4.2.1. Приготовление мазков из нативного материала

Обожженной в пламени спиртовки и охлажденной бактериологической петлей, одноразовой бактериологической петлей или сломанными концами деревянной палочки (новой для каждой порции мокроты) захватывают небольшое количество мокроты с гнойными комочками. Плотно прижав петлю или палочку перпендикулярно к стеклу, мелкими круговыми движениями распределяют гнойный комочек мокроты на поверхности предметного стекла как можно более тонким слоем на площади приблизительно 1-2 см х 2-3 см в виде овала.

Рисунок 4.1 – Приготовление мазка мокроты

Если мокрота очень вязкая, небольшой гнойный комочек захватывают пинцетом, осторожно отрезают ножницами и наносят его на середину предметного стекла. Толщина мазка в высушенном неокрашенном состоянии должна быть такой, чтобы можно было прочитать газетный шрифт, расположенный за стеклом на расстоянии 5-10 см

Если мазок слишком тонкий, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат. Если мазок слишком толстый, он может быть смыт с предметного стекла при окраске. На одном предметном стекле делают только один мазок.

Использованные для приготовления мазка палочки или одноразовую бактериологическую петлю сбрасывают в емкость с дезинфицирующим раствором или в контейнер с отработанным инфекционным материалом. Пинцет и ножницы обжигают в пламени горелки.

Приготовление мазков для микроскопического исследования является относительно опасной процедурой, во время которой может происходить рассеивание аэрозолей, содержащих возбудитель. В случае, когда мазок готовят с помощью бактериологической петли, необходимо обжигать петлю после каждой манипуляции в пламени спиртовой или газовой горелки до тех пор, пока она не станет красного цвета. Перед повторным использованием петлю тщательно прокаливают в пламени горелки, которое при этом должно быть бесцветным или голубым. Предпочтительнее использовать одноразовые бактериологические петли.

4.2.2. Приготовление мазка из осадка материала

Не рекомендуется готовить мазки способом “растяжки” материала между двумя предметными стеклами. Такой способ значительно увеличивает площадь мазка и более чем в 2 раза снижает возможность обнаружения КУБ.

Флотационные методы

Эти методы основаны
на принципе флотации: всплытие вследствие
низкой плотности яиц и личинок гельминтов
на поверхность исследуемой взвеси при
обработке пробы растворами различных
солей. Для вылавливания всплывших яиц
используют петлю из мягкой проволоки
с диаметром кольца 2-10 мм. При меньшем
диаметре затрудняется сбрасывание
капли на предметное стекло, а при большем
— пленка в кольце разрывается. Целесообразно
брать с поверхности от 3 до 6 капель в
зависимости от величины покровного
стекла. Если же поставлена цель —
обнаружить яйца, то исследуют поверхностный
слой капель без покровного стекла.

В настоящее время
для флотации предложено большое
количество насыщенных растворов солей:
хлорид натрия (поваренная соль) плотностью
1,18-1,20 (400г на 1л воды), нитрат аммония
(гранулированная или химически чистая
аммиачная селитра) плотностью 1,3 (1500г
на 1л воды), нитрат свинца (азотнокислый
свинец) плотностью 1,5 (6550 г на 1 л воды),
нитрат натрия (натриевая селитра)
плотностью 1,38-1,4 (100 г на 1 л воды), тиосульфат
натрия плотностью 1,4 (1750 г на 1 л воды),
хлорид цинка плотностью 1,82 (2000 г на 1 л
горячей воды), сульфат магния (английская
соль) плотностью 1,26-1,28 (920 г на 1 л воды).

Наилучшей
флотационной способностью обладают
растворы при t
20-22˚ С.

Методами флотации
следует пользоваться для диагностике
нематодозов и аноплоцефалезов. При
наличие соответствующих солевых
растворов с высокой плотностью можно
диагностировать и трематодозы.

Метод Фюллеборна.

5-8 грамм (можно
10-20 г) фекалий в стаканчик или фарфоровую
ступку и заливают небольшим количеством
насыщенного раствора поваренной соли.
После тщательного растворения фекалий
в смесь доливают 150-200 мл. раствора и
процеживают через сито в сухой и чистый
стакан размешивая стеклянной палочкой.
Взвесь отстаивают 10-15 мин. Затем с
поверхности отстоявшейся жидкости с
помощью металлической петли снимают
пленку, переносят ее на предметное
стекло для микроскопирования.

Метод Фюллеборна
рекомендуют применять главным образом
для обнаружения яиц круглых гельминтов
(аскарид, стронгилид, трихоцефалят и
других) и частично для ленточных червей
(тений, аноплоцефалид).

Метод Дарлинга.

Этот метод сочетает
процедуры осаждения и флотации. Фекалии
смешивают с водой до полужидкой
консистенции и центрифугируют 3-5 мин.,
вследствие чего яйца гельминтов
осаждаются на дно. Верхний слой жидкости
сливают, а к осадку добавляют жидкость
Дарлинга (глицерин, смешанный в равных
частях с насыщенным раствором поваренной
соли). И уже после этого яйца паразитических
червей из осадка всплывают на поверхность.
Металлической петлей пленку снимают
на предметное стекло, накрывают покровным
и исследуют. Применяют при диагностике
кишечных нематодозов.

3.1. Техника приготовления препаратов для микроскопии

Препараты
для микроскопии готовят на предметных
стеклах. Для работы необходимо иметь
специально приготовленные предметные
и покровные стекла, которые должны быть
чистыми и обезжиренными.

Новые
стекла моют в теплой воде с мылом. Для
обезжиривания их помещают на 2-3 дня в
смесь Никифорова (равные объемы спирта
и эфира в сосуде с притертой пробкой).

Если
предметные или покровные стекла были
в употреблении, их обрабатывают хромовой
смесью, промывают водой, кипятят 30-40 мин
в 5%-ном растворе соды.

Необработанные
стекла можно обезжирить, натерев их
мылом, а затем почистить сухой тканью.
Капля воды, нанесенная на хорошо
обезжиренное стекло, растекается
равномерно. На недостаточно обезжиренном
стекле вода распадается на мелкие капли.

В
зависимости от характера исследуемого
материала при его взятии используют
бактериологическую петлю или пастеровскую
пипетку. Петлю делают из платиновой или
нихромовой проволоки длиной 5-6 см и
закрепляют в петледержателе. На конце
проволоки делают петлю. Петлю держат,
как карандаш. Рабочую часть петли
стерилизуют в пламени горелки в
вертикальном положении, сначала конец
петли, затем петледержатель.

Приготовление
окрашенного препарата (мазка) состоит
из нескольких этапов (рис. 7): 1) приготовление;
2) высушивание; 3) фиксация; 4) окраска.

Рис.
7.
Схема приготовления препарата-мазка

1.
Приготовление
мазка

На
предметном стекле с обратной стороны
восковым карандашом обозначают место
мазка диаметром 2-3 см.

Из
культуры, выращенной на жидкой питательной
среде, стерильной петлей берут каплю
материала и распределяют на предметном
стекле. Из культур, выращенных на плотной
среде, петлей с поверхности берут
небольшое количество материала,
размешивают в заранее нанесенной на
предметное стекло капле физиологического
раствора или воды и размазывают по
стеклу.

Из
плотного патологического материала
(печень, почки, селезенка и др.) делают
мазки-отпечатки. Для этого стерильными
ножницами отрезают кусочек органа и
прикладывают к предметному стеклу,
делая один или несколько отпечатков.

2. Высушивание
мазка

Мазки
высушивают на воздухе при комнатной
температуре или в термостате.

3. Фиксация мазка

Мазки
фиксируют после полного высыхания с
целью:

1) закрепить мазок
на стекле;

2) убить бактерии;

3) убитые бактерии
лучше воспринимают краску.

Фиксацию
мазков осуществляют одним из двух
способов: физическим и химическим.
Физический метод заключается в трехкратном
проведении обратной стороной мазка
через пламя спиртовой горелки, задерживая
в пламени на 1-2 секунды.

При химическом
способе мазок погружают в жидкости:

а) этиловый спирт
96°-ный на 10-15 минут, или

б) смесь равных
объемов спирта и эфира на 10-15 мин, или

в) ацетон — 5 минут.

4. Окраска мазка

Бактерии
различно относятся к красителям, эти
свойства называют тинкториальными.