Андрей Смирнов
Время чтения: ~10 мин.
Просмотров: 1

Типы микроскопических препаратов. этапы приготовления фиксированного мазка. простые мето­ды окраски

Уборка лабораторного помещения

Помещение
лаборатории ежедневно до начала работы
следует убирать влажным способом. Пыль
с поверхностей протирают увлажненной
тряпкой, смоченной дезинфицирующим
раствором. После окончания работы стены,
покрытые метлахскими плитками или
окрашенные масляной краской, моют
горячей водой с мылом или стиральным
порошком. Полы моют 3-5% раствором
дезинфектанта. Потолки, карнизы, верхнюю
часть стен, окрашенные клеевой краской,
не реже одного раза в неделю очищают от
пыли пылесосом.

Подготовка
бокса к работе.

Помещение бокса регулярно обрабатывают
следующим образом: ежедневно перед
началом работы полы протирают
дезинфицирующим средством (2%-5% раствором
хлорамина); воздух обеззараживают
бактерицидными лампами, установленными
на высоте 2—2,5 м от поверхности пола, из
расчета одна лампа БУВ-ЗО (1,5—2,5 Вт) на
1 м3
помещения. При указанных условиях бокс
облучают 2—3 ч. Перед началом работы
лампы выключают. При отсутствии
бактерицидных ламп непосредственно
перед работой производят дезинфекцию
бокса, протирая помещение 5% раствором
хлорамина.

Чтобы
предотвратить заражение бокса, образцы
материалов, подлежащие исследованию,
вносят в бокс после предварительного
тщательного протирания 3% раствором
формалина. По этим же соображениям
работа в боксе проводится в стерильных
халатах, защитных масках и тапочках,
специально предназначенных для бокса.

Воздух
в боксе следует регулярно, не менее 2
раз в неделю, проверять на бактериальную
обсемененность.

Для
проверки чашки с мясо-пептонным агаром
и средой Сабуро оставляют открытыми в
течение 15 минут. Посев на мясо-пептонном
агаре выдерживают в термостате 48 ч при
37°С, чашки со средой Сабуро — 96 ч при
22°С. Допустимым ростом считается не
более 5 колоний на чашках. Количество
колоний, превышающее 5 при 15-минутной
экспозиции, является показателем высокой
обсемененности воздуха бокса. В этих
случаях по­мещение бокса нуждается
в дополнительной, более тщатель­ной
обработке. Не менее одного раза в неделю
помещение бокса моют горячей водой с
мылом, дезинфицирующими средствами и
протирают досуха.

Уборка
рабочего места.

По окончании работы бе­рут пинцетом
кусок ваты, смачивают его в 5% растворе
хлор­амина или в 5% растворе формалина
и протирают им поверхность стола на
рабочем месте. Такого рода повседневная
дезинфекция носит профи­лактический
характер.

Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.

Для
исследования живых клеток микроорганизмов
применяют методы
«раздавленной и висячей капли».

В обоих случаях возможно окрашивание
объекта “прижизненными” красителями
– “витальная” окраска.

Метод раздавленной
капли.

На
чистое предметное стекло наносят каплю
воды. В каплю вносят культуру и смешивают
с водой. Накрывают каплю покровным
стеклом так, чтобы не образовались
пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой
прижимают покровное стекло к предметному.
Капля должна быть небольшой, не выходящей
за края покровного стекла, но если
суспензия попала за край — удаляют
фильтровальной бумагой. Микроскопируют
препарат с объективом 40Х. Метод удобен
для исследования подвижности бактериальных
клеток, а также просмотра крупных
объектов — плесневых грибов, дрожжей.
Применяют при изучении запасных веществ
клетки. Метод “висячей”
капли

используются для длительных наблюдений
за клетками микроорганизмов. Препарат
готовят на покровном стекле, в центр
которого наносят одну каплю бактериальной
культуры. Затем предметное стекло с
лункой, края которой предварительно
смазывают вазелином, прижимают к
покровному стеклу так, чтобы капля
находилась в центре лунки. Быстрым
движением переворачивают препарат
покровным стеклом вверх. В правильно
приготовленном препарате капля должна
свободно висеть над лункой, не касаясь
её дна или края. Для микроскопии вначале
используют малый сухой объектив 8Х, под
увеличением которого находят край капли,
а затем устанавливают иммерсионный
объектив.

Прижизненная
(витальная) окраска.

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю
раствора метиленового синего или
нейтрального красного в концентрациях
от 0,001 до 0,00001%. Затем готовят препарат
по одному из выше указанных методов и
микроскопируют. После микроскопии
препараты, «раздавленной» или «висячей»
капли опускают в дезинфицирующий
раствор.

План занятия.

  1. Распространение
    микробов в окружающей среде. Роль
    микробов в живой и неживой природе.

  2. Микробиологическая
    лаборатория. Оборудование, правила
    работы, организация рабочего места.

  3. Методы
    изучения микроорганизмов (микроскопический,
    бактериологический, экспериментальный,
    серологический, кожно-аллергический).

  4. Микроскопический
    метод исследования. Виды современных
    микроскопов. Иммерсионная микроскопия.

  5. Тинкториальные
    свойства бактерий. Этапы приготовления
    мазков-препаратов. Простые методы
    окраски.

  6. Морфология
    бактерий. Измерение размеров микробных
    клеток.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

Исследование
микроорганизмов в живом состоянии
применя­ется главным образом для
изучения формы и подвижности бакте­рий,
реже при реакции агглютинации. Для этих
целей готовят препараты “раздавленная
капля” и “висячая капля” (рис. 5).

Препарат
“раздавленная капля”.

При приготовлении «раздавленной» капли
жидкость с исследуемым материалом
наносят на пред­метное стекло и сверху
накладывают покровное. Капли мате­риала
надо брать такой величины, чтобы они
заполняли все пространство между
покровным и предметным стеклом и не
вы­ступали за края покровного.

Препарат
“висячая капля”.

Для «висячей» капли необходимо
иметь предметное стекло с луночкой. На
покровное стекло предварительно наносят
каплю жидкости с исследуемой культурой
микроорганизмов. Затем на по­кровное
стекло накладывают предметное стекло,
с луночкой посередине, края которой
предварительно смазаны вазелином.
Предметное стекло слегка прижимают к
покровному, в резуль­тате чего оба
стекла склеиваются. После этого препарат
пере­вертывают покровным стеклом
кверху. Получается герметически закрытая
камера, в которой капля долго не высыхает.

Для
предотвращения быстрого высыхания
препараты рекомендуется помещать во
влажную камеру (чашку Петри), на дно
которой положено 2-3 влажных кружка
фильтровальной бу­маги, покрытых
двумя сухими.

При
изучении препаратов «раздавленная» и
«висячая капля» под световым мик­роскопом
край капли сначала отыскивают со слабым
увеличением и при суженой диафрагме, а
потом исследуют препарат при по­мощи
более сильного увеличения. Более удобными
для их микроскопического изучения
представляются такие виды микроскопии,
как темнопольная, фазово-контрастная
и аноптральная.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1.
Приготовить мазки из смеси культур
грамположительных и грамотрицательных
микроорганизмов, окрасить по Граму,
изучить под микроскопом.

Сложные
методы окраски предусматривают
последовательное использование
нескольких красителей различного
химического состава, что позволяет
выяснить определенные структуры
бактериальной клетки.

Окраска
по Граму.
Все бактерии по отношению
к окраске по Грамму делятся на
грамположительные – темно-фиолетового
цвета и грамотрицательные – красного.
Способность микроорганизмов окрашиваться
в тот или иной цвет зависит от их
химического состава. У грамположительных
бактерий в клеточной стенке отсутствуют
ароматические и серосодержащие
аминокислоты, отмечается низкое
содержание липидов, у грамотрицательных,
напротив, эти вещества содержатся в
большом количестве. Кроме того, у
грамположительных бактерий имеется
магниевая соль рибонуклеиновой кислоты,
которой нет у грамотрицательных. Она и
образует прочный химический комплекс
с белком, генциан-виолетом и йодом,
который не разрушается при кратковременном
действии спирта. У грамотрицательных
такой комплекс не образуется.

Подготовка предметных и покровных стекол

Предметные
и покровные стекла, употребляемые для
приго­товления препаратов, должны
быть чистыми и хорошо обезжирен­ными.
Это может быть достигнуто разными
способами. Стекла кипятят 15 мин в 1%
растворе соды (или мыльной воде),
спо­ласкивают водой, кладут в слабую
хлористоводородную кислоту и хорошо
промывают водой. Или же сначала выдерживают
стекла 2 ч в концентрированной серной
кислоте, затем моют их в воде, кипятят
в щелочи, вновь промывают водой. Стекла
можно также обрабатывать жидкостью
следующего состава (по Цетт­нову):
Kalii bichromici 20 г, Acidi
sulfurici crudi 20 г, воды 200 мл. После 10 мин
кипячения в этой смеси стекла про­мывают
5 мин в слабом растворе щелочи, а затем
промывают во­дой и, наконец, спиртом.
Хранят стекла в сосудах (банках) с
притертыми пробками в смеси равных
количеств спирта и эфира или в 96% спирте,
либо промытыми и вытертыми досуха.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1.
Ознакомиться с правилами работы в
микробиологической лаборатории.

Выполняя
микробиологические исследования,
необходимо соблюдать следующие правила:

— в лаборатории
должны работать в медицинских халатах,
шапочках и сменной обуви. Вход в
лабораторию без халата категорически
воспрещен. В необходимых случаях
работающие надевают на лицо маску из
марли. Работа с особо опасными микробами
регламентируется специальной инструкцией
и проводится в режимных лабораториях;

— с инфицированным
материалом работают только с помощью
инструментов (бактериологические петли,
пинцеты, корцанги и др.);

— прикасаться
руками к исследуемому материалу
запрещается;

— при посеве
материала делают надпись на пробирках
и чашках Петри и пр.;

— материал высевают
в пробирки и чашки Петри вблизи от
пламени горелки с обжиганием
бактериологической петли и краев
пробирки;

— растворы,
содержащие патогенные микроорганизмы,
забирают пипеткой с помощью резинового
баллона;

— в лаборатории
запрещается курить и принимать пищу;

— рабочее место
должно содержаться в образцовом порядке.
Личные вещи следует хранить в специально
отведенном месте;

В ходе работы и
по ее окончании применяются следующие
способы дезинфекции:

— при случайном
попадании инфицированного материала
на стол, пол и другие поверхности это
место необходимо тщательно обработать
дезинфицирующим раствором;

— руки обрабатывают
дезинфицирующим раствором, а затем моют
с мылом;

— помещение
дезинфицируют с помощью бактерицидных
ламп и путем обработки поверхности
лабораторной мебели дезинфицирующим
раствором.

2.
Ознакомиться с оборудованием
микробиологической лаборатории.

Лаборатории
снабжены рядом обязательных приборов
и аппаратов:

  1. Приборы
    для микроскопии: биологический
    иммерсионный микроскоп с дополнительными
    приспособлениями (осветитель,
    фазово-контрастное устройство,
    темнопольный конденсор и др.),
    люминесцентный микроскоп.

  2. Термостаты
    и холодильники.

  3. Приборы
    для приготовления питательных сред,
    растворов и т.д.: аппарат для получения
    дистиллированной воды (дистиллятор),
    технические и аналитические весы,
    рН-метры, аппаратура для фильтрования,
    водяные бани, центрифуги.

  4. Набор
    инструментов для манипуляций с микробами:
    бактериологические петли, шпатели,
    иглы, пинцеты и др.

  5. Лабораторная
    посуда: пробирки, колбы, чашки Петри,
    матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские
    и градуированные пипетки и др., аппарат
    для изготовления ватно-марлевых пробок.

  6. Аппаратура
    для стерилизации: автоклавы, сухожаровые
    шкафы, бактерицидные лампы.

Каждое
рабочее место снабжается спиртовкой и
сосудом с дезинфицирующим раствором.

3.
Приготовить мазок с агаровой культуры
стафилококка, окрасить метиленовой
синей, изучить под микроскопом.

Алгоритм приготовления мазка

из
культуры, выращенной на скошенном
агаре(«косячке»)

  1. Предметное
    стекло аккуратно берут за ребро и с
    обратной стороны нанесения мазка
    наносят его границы и номер культуры

  2. Зажигают
    спиртовку, горелку, предварительно
    выпустив пары спирта

  3. Фламбируют
    поверхность стекла, где будет располагаться
    мазок

  4. Стекло
    помещают вблизи спиртовки на чашку
    Петри

  5. В
    левую руку берут пробирку со стерильным
    физическим раствором (дистиллированной
    водой) и помещают между 1 и 2 пальцами
    таким образом, что ладонь находится
    под пробиркой и горлышко пробирки
    направлено в зону спиртовки

  6. В
    правую берут бактериальную петлю, как
    карандаш

  7. Петлю
    фламбируют до покраснения сначала
    горизонтально, затем вертикально (рис.
    №1)

Не
выпуская петли, мизинцем правой руки
прижимают пробку физ.р-ра к ладони и
осторожно вынимают е из пробирки.
Движения должны быть плавными

Горло
пробирки обжигают в пламени и вводят
петлю

Берут
выпускной петлей физ. р-р и выносят на
стекло пару капель в границы мазка

Закрывают
пробку, предварительно проведя через
пламя спиртовки пробку и горло пробирки
одновременно

Ставят
пробирку в штатив

В
левую руку берут пробирку с культурой
и помещают, как и пробирку с физ

р-ром
(см. пункт №5), петля в правой руке

Петлю
фламбируют

Над
пламенем спиртовки спокойно вынимают
пробку с культуры (см. пункт №8),
одновременно обжигая пробку и горло
пробирки

Вводят
в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки
пробирки

Осторожно
закрывают и захватывают петлей культуру,
не повреждая агара, и вынимают петлю,
не касаясь ею стенок пробирки

Петлю
с культурой вносят в каплю физ. р-ра и
осторожно эмульгируют, незаходя за
границы мазка

Бактериальную
петлю с остатками культуры прожигают
до покраснения в пламени спиртовки

Прожигают
горло пробирки пробку в пламени,
одновременно. Закрывают пробирку.

Пробирку
с культурой и петлю ставят в штатив

Приготовленный
мазок высушивают либо на воздухе либо
высоко над пламенем спиртовки

Примечание:

  1. Приготовление
    мазка из культуры, выращенной на жидкой
    питательной среде, не требует использования
    физ. р-ра. Мазок готовят согласно пунктам
    №13 -№22

  2. При
    приготовлении мазка из культуры,
    выросшей на чашке Петри необходимо:

отметить
изолированную колонию со стороны дна
чашки

чашку
берут в левую руку и в сторону спиртовки
приоткрывают крышку, придерживая ее
1и 2 пальцами левой руки

прокаленную
петлю вводят под крышку чашки, остужая
ее о крышку

осторожно
откалывают часть выделенной колонии
и, не задевая края чашки, выносят на
стекло с физ. р-ром

дальнейшие
манипуляции согласно пунктам №18, 19,
21, 22

  1. При
    подсушивании мазка следует помнить:
    высокая температура может нарушить
    структуру клетки

Рис.
№1.

Схема приготовления мазка

Виды
фиксации

  • Физический
    – в пламени спиртовки

  • Химический
    – в растворах спирта, ацетона, смеси
    Никифорова (1:1 спирт и эфир)

Цели
фиксации

  • Обеззараживание
    патогенных микробов

  • Закрепление
    клеток на стекле

  • Убитые
    микроорганизмы лучше воспринимают
    красители

Рейтинг автора
5
Материал подготовил
Максим Иванов
Наш эксперт
Написано статей
129
Ссылка на основную публикацию
Похожие публикации