Актуальные предложения
Специалистам » Молекулярно-генетические аспекты патогенеза синдрома поликистозных яичников

Молекулярно-генетические аспекты патогенеза синдрома поликистозных яичников

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА СИНДРОМА ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ

Е.Н. Андреева1, Т.В. Семичева1, А.Ф. Веснина1, С.А. Прокофьев1
  О.Н. Иванова1, Е.А. Карпова1, М.Ю. Кириллов2, И.И. Дедов1

1Эндокринологический научный центр РАМН,
2ЗАО "Лаборатория генно-инженерных систем "ЛАГИС", Москва


Представлены современные критерии диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), рассмотрены молекулярно-генетические аспекты патогенеза заболевания, клинико-гормональные особенности течения СПКЯ у лиц с разными генотипами изучаемых генов.


Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) - распространенная эндокринно-гинекологическая патология, диагностируемая у 5-10% женщин репродуктивного возраста [1, 6].

В настоящее время критериями СПКЯ, принятыми на Всемирном консенсусе в Нидерландах (2003) под руководством Европейского общества репродукции человека и эмбриологии и Американского общества репродуктивной медицины, являются два из следующих трех признаков:

1) олиго и/или ановуляция (оценивается по данным динамического ультразвукового исследования органов малого таза, данных функциональной диагностики); 
2) клинические и/или биохимические признаки гиперандрогении;
3) поликистозные изменения в яичниках (используется ультрасонография органов малого таза).

Диагноз СПКЯ исключается при наличии врожденной дисфункции коры надпочечников, андрогенпродуцирующих опухолей, гиперпролактинемии и синдрома Кушинга [2].

Известно, что СПКЯ имеет кластерное, семейное накопление, однако генетические механизмы, лежащие в основе функциональной гиперандрогении и СПКЯ, несмотря на многолетние исследования, до сих остаются неясными [3, 4, 6]. Вероятно, СПКЯ имеет полигенный (олигогенный или многофакторный) тип наследования [3, 4, 6, 7], в связи с чем большой интерес представляют работы, посвященные изучению генов-кандидатов заболевания. В 2004 г. было завершено секвенирование генома человека (IHGSC). Появилась возможность изучения влияния полиморфных маркеров всех генов, предположительно вовлеченных в патогенез заболевания, на его развитие и особенности клинических проявлений и течения, начата рационализация терапевтических подходов. Главным образом, изучение генов-кандидатов СПКЯ основывается на существующих теориях патогенеза, а так как заболевание часто сопряжено с наличием у больных абдоминального ожирения (40-46%) и нарушения чувствительности к инсулину (инсулинорезистентность и гиперинсулинемия встречается у 40-50% пациенток с нормальной и у 75% с избыточной массой тела), перспективными направлениями исследования считается изучение генов ферментов, вовлеченных в стероидогенез, и генов, участвующих в продукции и метаболизме инсулина, углеводном обмене. При этом на настоящий момент определено, что гены 17-гидроксилазы, 17,20-лиазы (CYP17), ароматазы (CYP19), ß-субъединицы ЛГ (LHß), ß-субъединицы ФСГ (FSHß), фоллистатина, гликоген синтетазы, рецептора дофамина (DRD2), фактора некроза опухолей (TNF), лептина (LEP), кальпаина (CAPN10), субъединиц рецептора инсулина (IRS) не являются маркерами СПКЯ [3-8].

В связи с предположением о влиянии на развитие СПКЯ полиморфизма в генах, включенных в стероидогенез, и генов, ответственных за синтез и действие инсулина, целью нашей работы явилось исследование двух генов-кандидатов, связанных с продукцией и чувствительностью тканей к инсулину и глюкозе, а также двух генов-кандидатов, участвующих в стероидогенезе и метаболизме андрогенов в периферических тканях. Так, для исследования были выбраны:

1. Мини-сателлитный полиморфизм в гене инсулина VNTR (variable number tandem repeat) INS, аллели III класса которого связаны с повышенной продукцией инсулина, а гомозиготный вариант III/III, согласно данным литературы [4, 6, 9], вероятно, связан с гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью у лиц, больных СПКЯ. 

2. Полиморфизм Pro12Ala в гене рецептора фактора пролиферации пероксисом PPARγ. По сведениям зарубежных авторов [6, 10, 11], указанный полиморфизм связан с развитием ожирения и может модулировать чувствительность к глюкозе и инсулину у лиц, больных СПКЯ, а так как данный рецептор является универсальным ядерным рецептором, регулирующим различные виды обмена веществ, изменения в кодирующей части могут быть связаны, в частности, с развитием абдоминального ожирения и инсулинорезистентностью у больных СПКЯ.

3. В исследовании предполагается изучить STR полиморфизм (shot tandem repeat) (tttta)n в гене фермента отщепления боковой цепи P450scc (STR CYP11А), длинные аллели которого с числом повторов более 16, по данным литературы [6], рассматриваются как фактор, возможно, обусловливающий развитие функциональной гиперандрогении надпочечникового и яичникового генеза.

4. Полиморфный маркер гена рецептора к андрогенам VNTR (CAG)n AR, для которого ранее было показано, что короткие аллели с числом повторов менее 22 связаны с активированием рецептора, а наличие большого числа повторов (>22) связано с метилированием промоторной области и инактивацией гена. Таким образом, полиморфизм в гене рецептора андрогенов может приводить к изменению чувствительности периферических тканей к андрогенам [3-8]. 


МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследовании типа случай-контроль, проведенном в ЭНЦ РАМН (2003-2005), участвовали 67 больных СПКЯ женщин в возрасте от 16 до 35 лет, средний возраст 22 (19; 26) года и 50 здоровых женщин (средний возраст 22 (19; 26) года (группы контроля), группы сопоставимы по этническим и возрастным показателям. Диагноз СПКЯ устанавливали на основе критериев, принятых на Всемирном консенсусе в Нидерландах (2003). Критериями исключения являлась диагностика других состояний, таких как врожденная дисфункция коры надпочечников, андроген-продуцирующие опухоли, гиперпролактинемия и синдром Кушинга [2]. Критериями включения в группу контроля были женский пол, возраст от 15 до 35 лет, отсутствие соматических и гинекологических заболеваний. Критериями исключения стали патология репродуктивной сферы, наличие родственников, больных СПКЯ.

Всем пациенткам было проведено стандартное обследование, включавшее сбор анамнеза жизни и развития заболевания, физикальную оценку с определением роста, массы тела, индекса массы тела (ИМТ; методика по Брею), отношения окружность талии/окружность бедер (ОТ/ОБ) (величина >0,83 расценивалась как перераспределение жировой клетчатки по абдоминальному типу), определение выраженности гирсутизма по шкале Ферримана-Галвея, наличия и интенсивности андрогензависимой дермопатии, алопеции. Клиническое обследование включало гинекологический осмотр, трансабдоминальное ультразвуковое исследование, оценку гормонального статуса и состояния углеводного обмена, чувствительности к инсулину, определение липидного профиля по стандартным методикам. Для оценки углеводного обмена и чувствительности к инсулину всем пациенткам выполняли стандартный пероральный тест толерантности к глюкозе (определение базального уровня глюкозы и иммунореактивного инсулина - ИРИ - в плазме венозной крови натощак и через 120 мин после нагрузки 75 г сухой глюкозы, разведенной в 200-250 мл воды). Определялась модель гомеостаза НОМА-IR (Нomeostasis Model Assessment), в баллах. Показатель НОМА-IR≥2,18 свидетельствует о наличии инсулинорезистентности. 

Всем участникам исследования было проведено молекулярно-генетическое тестирование на наличие полиморфных маркеров в генах - инсулина INS (VNTR), рецептора фактора пролиферации пероксисом PPARγ (Pro12Ala), фермента отщепления боковой цепи холестерина Р450scc - CYP11А (STR (tttta)n), рецептора к андрогенам AR (VNTR (CAG)n).

Для получения ДНК необходимой степени чистоты использовали фенол-хлороформный метод выделения ДНК из крови (Grimberg, 1989). Генотипирование проводили на амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) в 30 мкл реакционной смеси следующего состава: 67мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,7 мМ сульфат аммония, 0,01% твин-20, 1,0 мМ хлорид магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 1,5 ед. полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК. В реакционную смесь вносили по 50 нг каждого из праймеров. Для выявления полиморфизмов использовался метод полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией (для генов PPARγ и INS) или выявлением полиморфизмов длин повторов электрофорезом в агарозном геле (для генов AR и CYP11a).

В связи со значительной трудоемкостью стандартной методики определения полиморфизма INS VNTR использовалась модифицированная методика выявления полиморфного маркера в промоторной области гена инсулина, выявляемого по расщеплению рестриктазой Hph I, находящаяся в неравновесном сцеплении с аллелями полиморфного мини-сателлита INS VNTR. [14]. Использованы следующие праймеры: Ins(HphI) F 5’-TCC AGG ACA GGC TGC ATC AG-3’, R 5’-AGC AAT GGG CGG TTG GCT CA-3’. PPARγ (Pro 12 Ala) - F 5’-CTG ATG TCT TGA CTC ATG GG-3’ и R 5’-GGA AGA CAA ACT ACA AGA GC-3’. AR (CAG)n)) F 5’-CTG AGC AAG AGA AGG GGA GGC-3’ GGG GTA AGG GAA GTA GGT GGA-3’ и R 5’-CGA CTG CGG CTG TGA AGG TTG-3’ CTG TTC CTC ATC CAG-3’. CYP11a (tttta)n F 5’-GGT GAA ACT GTG CCA TTG C-3’ и R 5’-GTT TGG GGG AAA TGA GGG GC-3’.

Статистическую значимость отличия частот в контрольной и исследуемой выборке оценивали с помощью критерия χ2 Пирсона с поправкой Йетса. Сравнительные количественные данные представлены в виде Ме - медиана (25% и 75% перцентили). Значимость различий количественных признаков у носителей разных генотипов устанавливали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA, метод Крускала-Уоллиса) и метода Манна-Уитни (SPSS 13.0 для Windows). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для выявления влияния изучаемых нами генов-кандидатов на развитие СПКЯ было проведено сравнение частот аллелей и генотипов в группах больных СПКЯ и здоровых женщин. В случае выявления связи заболевания с изучаемым полиморфным маркером в выборке больных с заболеванием ожидалось изменение частоты распространения генотипов и аллелей в сравнении с контролем. Полученные данные распределения частот аллелей и генотипов у пациенток с СПКЯ и контрольной группы представлены в табл. 1-5.

INS VNTR 
Группа пациенток с СПКЯ достоверно отличалась по частотам генотипов (p=0,026) от контрольной группы. При этом частота генотипа III/III у больных (16,5%) превышала таковую в контрольной группе (2%) почти в 8 раз (см. табл. 1).

PPARγ
Достоверных различий по частотам генотипов у больных СПКЯ и в контрольной группе получено не было (см. табл. 2). Учитывая данные многочисленных публикаций [6, 10, 11] о различном распределении частот генотипов у лиц с абдоминальным типом ожирения и лиц с нормальным типом распределения жировой ткани мы разделили больных СПКЯ на соответствующие группы. В группе больных СПКЯ с абдоминальным ожирением выявлено значимое преобладание полиморфного генотипа Pro12Ala (см. табл. 3). Пациентки с нормальной массой тела по распределению частот вариантов гена не отличались от здоровых девушек.

AR 
При определении распространения изученных генотипов гена AR мы не получили подтверждения данных литературы о повышенной частоте у больных СПКЯ аллелей (CAG)n с числом повторов более 22. Достоверных различий по распределению генотипов (CAG)n в группе больных и контрольной группе получено не было. Однако изучение распределения генотипов у больных СПКЯ требует дальнейшего исследования в связи с отсутствием единых методических критериев формирования групп гетерозигот (см. табл. 4).

CYP11А
Обнаружено, что пациентки с СПКЯ достоверно отличались по генотипу CYP11A от группы контроля. В группе больных девушек отмечено уменьшение процента больных, гомозиготных по аллелям с числом повторов менее или равно 16, и увеличение доли гетерозиготного носительства (см. табл. 5).

Таким образом, мы выявили значимые различия в распределении частот генотипов для полиморфных маркеров трех из изученных генов - INS, PPARγ и CYP11А.

Для оценки возможного влияния полиморфизмов изученных генов на особенности клинических проявлений и течения заболевания данные генотипирования были сопоставлены с результатами анамнестических и клинико-гормональных исследований. 

При изучении анамнестических данных у пациенток-носителей полиморфных маркеров генов и пациенток с нормальными вариантами генов (встречающихся с наибольшей частотой в группе контроля) отмечено, что возраст наступления заболевания и интервал от момента менархе до дебюта СПКЯ (табл. 10) были статистически достоверно меньше у пациенток, носителей генотипов (CAG)n >22 />22 гена рецептора андрогенов (табл. 9) и гетерозиготного варианта Pro12Ala PPARγ (табл. 8). Тогда как пациенткам с генотипом III/III INS VNTR генов инсулина (табл. 7) и вариантом SТR CYP11А >16 />16 (см. табл. 10), наоборот, было свойственно более позднее начало заболевания и более длительное время до развития первых его симптомов.

Выявлено, что полиморфизм Pro12Ala в гене PPARγ вносит вклад в формирование типа и развитие ожирения у пациенток с СПКЯ. Так, при оценке физических данных больных отмечено, что достоверное увеличение ИМТ, коэффициента ОТ/ОБ наблюдалось у пациенток с генотипом PPARγ Pro12Ala по сравнению с больными с генотипом PPARγ Pro12Pro (см. табл. 6). 

Отмечено влияние носительства генотипа INS VNTR III/III на продукцию инсулина и чувствительность к нему у пациенток с СПКЯ. Так, при сравнительном анализе клинических показателей выявлено, что инсулинорезистентность и гиперинсулинемия натощак обнаруживались достоверно чаще у пациенток с генотипом INS VNTR III/III, чем у обладательниц варианта INS VNTR I/I (табл. 7).

Для оценки роли полиморфизма гена PPARγ в развитии инсулинорезистентности при СПКЯ с целью исключения ошибочных результатов в связи с влиянием на показатели углеводного обмена и чувствительности к инсулину нарушений в жировом обмене пациентки были ранжированы по массе тела и распределению жировой ткани. Таким образом, было получено, что у пациенток с генотипом Pro12Pro PPARγ инсулинорезистентность и гиперинсулинемия натощак обнаруживались достоверно чаще, чем у обладательниц генотипа Pro12Ala. Данные изменения статистически достоверно прослеживались у пациенток и с нормальной, и с избыточной массой тела (табл. 8).

У пациенток с гомозиготным вариантом n≤22/≤22 AR VNTR (CAG)n клинически гиперандрогения (т.е. гирсутизм, интенсивность андрогензависимой дермопатии) была более выражена, чем у носителей гомозиготного генотипа с n>22 />22. Однако также отмечено, что пациентки с данным генотипом характеризовались более высокими показателями фракций андрогенов в крови, а также уровнем НОМA (табл. 9) [13]. Таким образом, на настоящий момент нет убедительных доказательств изолированного влияния полиморфизма гена рецептора к андрогенам на кожную вирилизацию у пациенток с СПКЯ [13].

Значительно более яркая клиника и величины биохимических показателей гиперандрогении были обнаружены у носителей генотипов Pro12Pro генов PPARγ и I/I INS VNTR, тогда как больные с иными генотипами в данных генах характеризовались меньшей выраженностью симптомов и умеренными цифрами гормональных показателей, что, вероятно, в случае носительства генотипа INS VNTR I/I не связано с прямым действием гена, а косвенно обусловлено большей длительностью компенсаторных реакций организма при развитии СПКЯ при первичном дефекте выработки инсулина (см. табл. 7-9).


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, у пациенток с СПКЯ обнаружено изменение частот распределения генотипов генов INS VNTR, PPARγ и CYP11А. Выявлена взаимосвязь выраженности клинических и биохимических проявлений гиперандрогении при СПКЯ и наличия полиморфизма в генах AR, PPARγ и INS. Определена связь инсулинорезистентности и гиперинсулинемии у больных СПКЯ с изменениями в генах инсулина и PPARγ. 

Учитывая вышеизложенное, мы предлагаем использовать молекулярно-генетическое тестирование генов INS VNTR, PPARγ у девочек и подростков, имеющих отягощенный семейный анамнез по СПКЯ, как современный метод скрининга для профилактики факторов, способствующих развитию заболевания, и выбора адекватной тактики ведения.



 


 ЛИТЕРАТУРА

1. Пищулин А.А. Синдром поликистозных яичников: патогенез, диагностика, лечение: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М 2003.
2. The Rotterdam ESHRE/ASRM-sponsored PCOS consensus workshop group 2004 Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome (PCOS). Hum Reprod 2004;19:41-47.
3. Legro R.S. Polycystic ovary syndrome. Phenotype to genotype. Endocrinol Metab Clin North Am 1999;28:379-396.
4. Franks S., Gharani N., McCarthy M. Candidate genes in polycystic ovary syndrome. Hum Reprod Update 2001;7:405-410.
5. Urbanek M., Legro R.S., Driscoll D.A. et al. Thirty-seven candidate genes for polycystic ovary syndrome: strongest evidence for linkage is with follistatin. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:8573-8578.
6. Escobar-Morreale H.F., Luque-Ramirez M., San Millan J. The molecular-genetic basis of functional hyperandrogenism and the polycystic ovary syndrome. Endocrine Reviews 2004.
7. Franks S., McCarthy M.I., Hardy K. Development of polycystic ovary syndrome: involvement of genetic and environmental factors. Int J Androl 2006;29:1:278-285.
8. Xita N., Georgiou I., Tsatsoulis A. The genetic basis of polycystic ovary syndrome. Eur J Endocrinol 2002;147:6:717-725.
9. Waterworth D.M., Bennett S.T., Gharani N. et al. Linkage and association of insulin gene VNTR regulatory polymorphism with polycystic ovary syndrome. Lancet 1997;349:986—990.
10. Tok E.C., Aktas A., Ertunc D. et al. Evaluation of glucose metabolism and reproductive hormones in polycystic ovary syndrome on the basis of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-gamma2
Pro12Ala genotype. Hum Reprod 2005;20:6:1590-1595.
11. Hahn S., Fingerhut A., Khomtsiv U. et al. The peroxisome proliferator activated receptor gamma Pro12Ala polymorphism is associated with a lower hirsutism score and increased insulin sensitivity in women with polycystic ovary syndrome. Clin Endocrinol (Oxford) 2005;62:5:573-579.
12. Hansen S.K., Gjesing A.P., Rasmussen S.K. et al. Large-scale studies of the HphI insulin gene variable-number-of-tandem-repeats polymorphism in relation to type 2 diabetes mellitus and insulin release. Diabetologia 2004;47:1079-1087.
13. Mohlig M., Jurgens A., Spranger J. et al. The androgen receptor CAG repeat modifies the impact of testosterone on insulin resistance in women with polycystic ovary syndrome. Eur J Endocrinol 2006;155:1:127-130.


© «Проблемы репродукции», №6, 2007
 

Вернуться