Актуальные предложения
Специалистам » Инструкция по сбору, хранению и транспортировке биологического материала для исследования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Инструкция по сбору, хранению и транспортировке биологического материала для исследования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Биологический материал, поступающий на исследование в лабораторию «ЛАГИС», должен находиться в маркированных пробирках (контейнерах) и сопровождаться заполненным индивидуальным направлением в одном экземпляре.

Направление должно содержать следующие сведения: дату, № пробирки, наименование учреждения, направившего на исследование биоматериал, фамилию врача, забравшего материал, ФИО пациента, возраст пациента, предварительный диагноз.

ВНИМАНИЕ! При заборе биоматериала без учета требований Инструкции, Лаборатория не несет ответственности за достоверность полученных результатов. Методы забора, транспортировки и хранения биоматериала, не оговоренные в настоящей Инструкции, должны быть согласованы со специалистами Лаборатории «ЛАГИС».


 

ХРАНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

 

  • Мазки, соскобы в транспортном растворе в цветной пробирке типа эппендорф - в холодильной камере (+40С - +80С) - до 7 дней, в морозильной камере (-100С - -200С) - до 14 дней (размораживать можно один раз).
  • Биологические жидкости (нативный биоматериал) –   в холодильной камере (+40С - +80С) - не более суток, в морозильной камере (-100С - -200С) - до 2-х недель:  
    • моча,
    • мокрота,
    • сок предстательной железы,
    • сперма,
    • синовиальная жидкость,
    • смывы и др.
  • Кал – не подлежит хранению, доставить в лабораторию на холоде в день забора до 15 часов (кроме пятницы и предпраздничных дней!).
  • Кровь с ЭДТА - в холодильной камере (+40С - +80С) – для определения возбудителей инфекций – не более суток, для генетических исследований – до 4-х дней. Замораживанию не подлежит.
  • Биоптаты - в холодильной камере (+40С - +80С) - не более суток, в морозильной камере (-100С - -200С) - до 2-х недель.

ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ МЕТОДОМ ПЦР

1. Соскобы и мазки

Общие рекомендации

  1. Забор биоматериала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции (для этого необходимо учитывать входные ворота, пути распространения, места размножения и пути выделения искомых микроорганизмов).
  2. Количество забранного материала должно быть небольшим (особенно отделяемого – не больше, чем «со спичечную головку»). Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.
  3. При внесении биоматериала, взятого у пациента зондом с ватным тампоном или щеточкой в цветную пробирку типа эппендорф с транспортным раствором*, необходимо:
    • соблюдать стерильность;
    • прежде, чем погружать собранный на тампоне (щеточке) материал в раствор, размазать его по сухой стенке пробирки, затем смочить тампон (щеточку) в растворе и, вращая зонд, тщательно смыть весь материал со стенки пробирки и тампона (щеточки);
    • по возможности отжать тампон о стенку пробирки, УДАЛИТЬ зонд с тампоном (щеточкой) и сразу закрыть пробирку.

Цель этих манипуляций – максимально эффективно перенести биоматериал в раствор и получить однородную взвесь без крупных слизистых комков.

*ВАЖНО: транспортная среда разработана для забора только мазков и соскобов. Не допускается забор других биоматериалов в данные пробирки.

1.1 Соскобы

Для соскобов используются одноразовые стерильные зонды с ватным тампоном с повышенной адсорбцией или щеточкой, реже - ложки Фолькмана, малые ушные ложки или аналогичные инструменты со слегка затупленными краями. Поскабливающими движениями собрать материал. Исследуемый материал должен содержать возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи, примесей крови и экссудата. Внести материал в стерильную цветную пробирку типа эппендорф с транспортным раствором, выполняя правила (см. выше). Не забудьте УДАЛИТЬ зонд!

Соскоб из цервикального канала

Перед взятием соскоба необходимо удалить избыток слизи стерильным ватным тампоном, обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, избегая соприкосновения со стенками влагалища, и поскабливающим движением (не до крови) собрать материал. Небольшое количество эритроцитов в пробе не влияет на результат анализа. При наличии эрозии шейки матки материал берут с границы здоровой и измененной ткани.

Соскоб из уретры

Зонд ввести в уретру (у мужчин - на глубину 2-4 см) и несколькими вращательными движениями собрать материал. Накануне перед взятием материала допускается провокация (острая пища, алкоголь и др.). Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение одного-двух часов перед взятием пробы. При наличии обильных гнойных выделений соскоб надо брать не позже, чем через 15 минут после мочеиспускания.

Соскоб с конъюнктивы

Соскоб с конъюнктивы берут, предварительно проведя анестезию глаза 0,5% раствором дикаина. Вывернув веко, зондом с ватным тампоном (либо глазным скальпелем) собрать эпителиальные клетки с конъюнктивы.

Соскоб из прямой кишки

Зонд ввести в анальное отверстие на глубину 3-4 см и вращательным движением собрать материал.

1.2 Мазки

Одноразовым стерильным зондом с ватным тампоном или щеточкой взять небольшое количество отделяемого (со сводов влагалища, из зева, носоглотки и др.) и перенести в стерильную цветную пробирку типа эппендорф с транспортным раствором, выполняя правила (см. выше).

Не забудьте УДАЛИТЬ зонд!

Для взятия мазка из горла: не полоскать горло, натощак взять мазок назофарингиальным зондом с задней стенки носоглотки.

2. Мокрота

Утром натощак провести санацию ротовой полости и горла (прополоскать раствором питьевой соды), затем собрать мокроту в пустой стерильный широкогорлый контейнер с плотно завинчивающейся крышкой. Не допускается забор мокроты в пробирку типа эппендорф с транспортным раствором.

3. Слюна, желудочный сок, ликвор, синовиальная жидкость

1-1,5 мл - поместить в пустую стерильную пробирку (контейнер). Не допускается забор жидкого биоматериала в пробирку типа эппендорф с транспортным раствором.

4. Сок предстательной железы

После массажа предстательной железы сок собирают в количестве 0,5-1 мл в пустую стерильную пробирку (контейнер). При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи в количестве 10 мл (в этой порции содержится сок предстательной железы). Не допускается забор жидкого биоматериала в пробирку типа эппендорф с транспортным раствором.

5. Сперма

Собрать сперму (1-1,5 мл) в пустой стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой. Не допускается забор спермы в пробирку типа эппендорф с транспортным раствором.

6. Смывы

Стерильным ватным тампоном и 5-7 мл физиологического раствора, проводят смыв, например, с наконечника эндоскопа или бронхоскопа, и помещают в пустую стерильную пробирку (контейнер). Не допускается забор жидкого биоматериала в пробирку типа эппендорф с транспортным раствором.

7. Моча

Собирают утренние первую или среднюю порции мочи в пустой стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой в количестве минимум 10 мл. Если забор мочи проводят днем, то перед этим пациент не должен мочиться 1,5-3 часа. Не допускается забор мочи в пробирку типа эппендорф с транспортным раствором.

8. Фекалии

1вариант:
Зонд с ватным тампоном помещают внутрь каловых масс и слегка проворачивают, захватывая небольшое количество материала («со спичечную головку»). Затем материал помещают в стерильную пробирку типа эппендорф с транспортным раствором. Для этого проворачивают зонд по сухой стенке пробирки, а затем смывают зондом мазок со стенок. Не забудьте УДАЛИТЬ зонд!

2 вариант:
Кал - в пустой стерильный стаканчик (1-3 г – чайная ложка).

9. Биоптат

Забор материала осуществлять из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или пограничного с повреждением участка. Поместить биоптат в стерильную пробирку со стерильным физраствором или водой (не более 0,5мл) или в пустую стерильную пробирку, если биоптат находится в биологической жидкости.

10. Кровь

Для ПЦР-исследований кровь должна быть нативной (не свернувшейся). Для проведения исследований крови методом ПЦР момент забора крови не имеет значения (не обязательно утром натощак).

Кровь собрать асептически, путем венопункции - в фирменную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА до метки, аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку, и поместить в холодильную камеру (+4?С - +80С). Нельзя использовать гепарин в качестве антикоагулянта!

Кровь с ЭДТА является биологическим материалом для следующих групп исследований:

1) Генетические исследования: из клеток нативной крови выделяют ДНК человека и затем проводят ПЦР-анализ определенных генов человека.

2) Выявление возбудителей инфекций: микроорганизмы могут оказаться в крови человека в определяемом количестве во время обострения некоторых хронических диссеминированных форм инфекционных заболеваний. Наиболее информативными являются пробы крови, взятые при ознобе, повышенной температуре у пациента, т.е. во время виремии или бактериемии.

Микроорганизмы, которые возможно выявить в крови методом ПЦР
Микроорганизмы Когда имеет смысл исследовать кровь методом ПЦР
Микоплазмы
Уреаплазмы
Хламидии
При артритах и других диссеминированных формах инфекций, в период обострения
Токсоплазмы В острой стадии, при паразитемии
Листерии При нервной и септической форме листериоза
Вирус простого герпеса
Цитомегаловирус
Вирус Эпштейна-Барр
При субфебрилитете неясной этиологии, в лихорадочный период, при сниженном уровне иммунитета, пневмониях и др.
Стрептококки
Синегнойные палочки
Кандиды
При резко сниженном уровне иммунитета, во время бактериемии, при пневмониях, у онкологических больных, при диссеминированном микозе
Туберкулезные палочки При диссеминированной форме, в дополнение к другим пробам


 

Микроорганизмы, которые нецелесообразно определять в крови методом ПЦР, т.к. они отсутствуют в крови даже при развитии инфекционного процесса, вызванного ими (исключения крайне редки)
Микроорганизмы Исключения
Трихомонады -
Гонококки Диссеминированная инфекция, септицемия новорожденных
Гарднереллы Послеродовая бактериемия
Папилломавирусы -
Бордетеллы -
Геликобактер -
Все анаэробы Диссеминированная инфекция, сепсис

ОСОБЕННОСТИ ЗАБОРА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА для ПЦР-исследований возбудителей инфекций

У женщин забор биоматериала рекомендуется делать накануне менструации или сразу после окончания (для выявления трихомонад - на 10-15 день после начала менструации), т.к. в эти периоды при наличии заболевания численность возбудителей максимальна. При хронических, персистирующих, вялотекущих инфекционных процессах целесообразно проводить забор материала после провокаций.

Если целью лабораторного обследования является выявление различных возбудителей урогенитальных инфекций, а также нормофлоры влагалища, то для получения репрезентативной пробы при заборе биоматериала необходимо использовать смешанную технику соскоба/мазка: соскоб из цервикального канала, затем - мазок с заднего свода и стенок влагалища. Таким образом, в одну пробирку попадут микроорганизмы, вызывающие инфекционные процессы в разных областях половой сферы. Из цилиндрического эпителия цервикального канала - клеточные паразиты (микоплазмы, хламидии, вирусы); из влагалища - лактобактерии, гарднереллы, грибы, гонококки, трихомонады и др. Из такой пробы биоматериала можно провести более 20-и ПЦР-исследований, т.е. проверить пробу на содержание в ней более чем 20-и различных микроорганизмов.

У мужчин при обследовании на урогенитальные инфекции репрезентативными являются пробы: соскоб/мазок из уретры, сок простаты, утренняя первая порция мочи.

У детей, в зависимости от предварительного диагноза, для исследований методом ПЦР многих инфекций репрезентативными являются пробы мазков/соскобов со слизистой оболочки преддверия влагалища, носоглотки, конъюнктивы, а также пробы отделяемого из уретрального канала, мочи, крови, ликвора, мокроты, бронхоальвеолярного лаважа.

Т.к. передача урогенитальных инфекций возможна от матери к плоду при прохождении родовых путей, то возбудители урогенитальных инфекций могут оказаться этиологическими агентами различных заболеваний новорожденных, в частности пневмоний. При этом входными воротами для возбудителей инфекций являются все слизистые оболочки новорожденного. Клиническим материалом для поиска возбудителей в таких случаях могут быть мазки-соскобы со всех слизистых оболочек, отделяемое носоглотки, моча, а также кровь новорожденного.

Таблица 1: Виды биологического материала детей, репрезентативные (информативные) для ПЦР-исследований, в зависимости от возбудителя инфекции
Название микроорганизма Виды биоматериала, репрезентативные по данному микроорганизму
Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, U. urealyticum, U. parvum 1) Отделяемое из уретры, моча,
2) Соскоб/ мазок из вульвы,
3) Соскоб с конъюнктивы,
4) Кровь (при диссеминированном типе инфекции в период обострения),
5) Мокрота, мазок из носоглотки, зева.
Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae 1) Соскоб/мазок, отделяемое из вульвы,
2) Отделяемое из уретры, моча,
3) Соскоб/мазок со слизистых оболочек зева, прямой кишки,с конъюнктивы.
Gardnerella vaginalis 1) Отделяемое из вульвы, из уретры, моча.
Candida albicans 1) Отделяемое из вульвы, из уретры, моча,
2) Мокрота, мазок/смыв из носоглотки и зева.
Toxoplasma gondii 1) Кровь, ликвор, пунктаты лимфатических узлов,
2) Биопсийный материал из потенциально пораженных органов.
Listeria monocytogenes 1) Кровь, ликвор, пунктаты лимфатических узлов,
2) Отделяемое из вульвы, из уретры, из других очагов заболевания (со слизистых оболочек зева и прямой кишки), моча.
Вирус простого герпеса, Цитомегаловирус, Вирус Эпштейна-Барр 1) Соскобы из носоглотки, зева, слюна, мокрота,
2) Кровь, ликвор, пунктаты лимфатических узлов,
3) Моча, биоптаты.


 

Таблица 2: Виды биологического материала, репрезентативные для ПЦР-исследований, в зависимости от возбудителя инфекции
Название микроорганизма, биологические особенности Виды биоматериала, репрезентативные по данному микроорганизму
Lactobacillus sp. - нормофлора влагалища. Колонизируют плоский эпителий влагалища. Соскоб / мазок с заднего и боковых сводов влагалища.
Возбудители урогенитальных инфекций
Chlamydia trachomatis - возбудитель урогенитального хламидиоза, хламидийного кератоконьюнктивита и др. – рекомендуется трехкратный забор материала с интервалом в 2 недели.
Внутриклеточные паразиты (преимущественно–цилиндрический эпителий).
1) Соскоб из уретрального и цервикального каналов,
2) Соскоб с конъюнктивы,
3) Материалы, полученные при лапароскопии или лапаротомии, биопсийный материал (эндометрий), сок предстательной железы - для диагностики восходящих хламидиозов,
4) Моча, секрет простаты, сперма,
5) Кровь (при диссеминированном типе инфекции в период обострения),
6) Суставная жидкость при артритах.
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma sp., U.urealyticum, U. parvum - возбудители микоплазмозов, уреаплазмозов (урогенитального и экстрагенитального).
Мембранные паразиты (цилиндрический и плоский эпителии, другие клетки).
1) Соскобы из уретрального и цервикального каналов, со сводов влагалища, периуретральной области, крайней плоти,
2) Моча – утренние первая и средняя порции,
3) Секрет простаты, сперма,
4) Кровь – при артритах и других диссеминированных инфекциях в период обострения,
5) Суставная жидкость при артритах.
Trichomonas vaginalis – возбудитель урогенитального трихомониаза.
Тканевые паразиты (межклеточное пространство, в отделяемом)
1) Соскоб/мазок с заднего свода влагалища, из уретрального и цервикального каналов,
2) Секрет простаты,
3) Содержимое парауретральных ходов, бартолиниевых и скеневских желез,
4) Соскоб/мазок со слизистых оболочек зева, прямой кишки.
Neisseria gonorrhoeae – возбудитель гонореи.
Клетки цилиндрического эпителия, субэпителиальная соединительная ткань (внутри- и внеклеточно, в отделяемом).
1) Соскоб/мазок из уретрального и цервикального каналов,
2) Соскоб/мазок из влагалища,
3) Соскоб/мазок из прямой кишки, глотки,
4) Секрет предстательной железы, сперма, моча,
5) Соскоб с конъюнктивы,
6) Суставная жидкость (при артритах),
7) Кровь (при септицемии, эндокардитах).
Gardnerella vaginalis - возбудитель гарднереллеза, маркер бактериального вагиноза.
Плоский эпителий влагалища (в межмембранном пространстве – «ключевые клетки»).
1) Соскоб/мазок с заднего свода влагалища,
2) Соскоб/мазок из уретры.
Mobiluncus sp., Mobiluncus curtisii, Fusobacterium sp., Fusobacterium nucleatum, Prevotella sp., Bacteroides sp., Atopobium vaginae - маркеры бактериального вагиноза 1) Соскоб/мазок с заднего свода влагалища,
2) Соскоб/мазок из уретры
Streptococcus agalactiae (Str. group B) - осложнения беременности, пневмонии новорожденных и др. 1) Мазок из влагалища,
2) Мазок/соскоб с любых слизистых новорожденных,
3) Мазок из носоглотки и зева,
4) Моча.
Candida albicans – возбудитель кандидоза.
Слизистые оболочки и др.ткани (внутри и внеклеточно).
1) Мазок с заднего свода влагалища,
2) Мазок из уретрального канала, с крайней плоти,
3) Моча, мазки из носоглотки и зева, мокрота.
Toxoplasma gondii - возбудитель токсоплазмоза.
Различные ткани (внутриклеточные паразиты).
Listeria monocytogenes - возбудитель листериоза. Различные ткани (внутриклеточно, внеклеточно).
1) Ликвор, пунктаты лимфатических узлов, биопсийный материал,
2) Околоплодные воды, остатки плодных оболочек,
3) Кровь - клетки периферической крови, менструальная кровь,
4) При обследовании беременных - соскоб из цервикального канала, с заднего свода влагалища.
Возбудители вирусных инфекций
Human Papillomavirus HPV/ВПЧ – вирус папилломы человека (разные типы) – вызывают папилломатозы.
Клетки различных эпителиев. Внутриклеточные паразиты.
1) Соскоб из цервикального канала, с шейки матки, уретры,
2) Соскоб с пораженных участков слизистых,
3) Биоптаты – ткани очага поражения.
HSV / ВПГ 1,2 - вирусы простого герпеса 1 и 2 типов.
Клетки различных эпителиев – во время обострения, клетки нервных ганглиев – во время латенции.
Внутриклеточные паразиты.
1) Соскоб из уретрального и цервикального каналов,
2) Соскоб с пораженных участков кожи и слизистых, с ранее пораженных мест,
3) Моча,
4) Кровь (клетки крови) – при виремии,
5) Ликвор, лейкоциты периферической крови при диссеминированной форме.
CMV / ЦМВ (цитомегаловирус) - возбудитель цитомегалии, ЦМВ- пневмонии, различных диссеминированных поражений.
Способен поражать практически все органы и ткани.
Внутриклеточные паразиты.
1) Ликвор, кровь (клетки крови),
2) Моча,
3) При обследовании беременных - соскоб из уретрального, цервикального каналов,
4) Слюна, мокрота,
5) Смывы с бронхов, лаваж,
6) Биоптаты (печени, почек и др.).
HSV IV - Epstein Barr virus – вирус Эпштейна-Барр (герпесвирус 4 типа) - возбудитель инфекционного мононуклеоза и др.
При латентной форме – преимущественно В-лимфоциты.
Внутриклеточные паразиты.
1) Пунктаты лимфатических узлов,
2) Мазок из носоглотки и зева, слюна,
3) Кровь, ликвор,
4) Биоптаты.
Возбудители других инфекций
Streptococcus pyogenes (group A Str.) - различные стрептококковые инфекции. 1) Соскоб/мазок из зева натощак,
2) Кровь,
3) Соскоб/мазок из цервикального канала, с заднего свода влагалища.
Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci - возбудители пневмонии, ОРЗ, артритов и др.
Внутриклеточные паразиты.
1) Мокрота, соскоб с задней стенки носоглотки и из зева,
2) Кровь (при обострениях),
3) Суставная жидкость (при артритах).
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium complex (MAC) - возбудители туберкулеза – рекомендуется трехкратный забор материала.
В различных тканях (внутриклеточно и в межклеточном пространстве).
1) Мокрота, БАЛ,
2) Соскоб/мазок из уретрального и цервикального каналов,
3) Биопунктаты,
4) Мазок из носоглотки и зева,
5) Моча, кровь.
Pseudomonas aeruginosa - возбудитель синегнойных инфекций.
Внутритканно, внеклеточно, в отделяемом.
1) Мазок из ран,
2) Мокрота, мазок из носоглотки, зева,
3) Мазок из влагалища,
4) Моча,
5) Кровь (при резко сниженном имунитете).
Bordetella pertussis, bordetella sp. - возбудители коклюша и паракоклюша. 1) Мокрота,
2) Мазок из зева натощак.
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Pneumocystis carinii (jiroveci), Aspergillus sp. – возбудители бронхолегочных инфекций. 1) Мокрота,
2) Мазок из зева, носоглотки натощак,
3) Кровь (при снижении иммунитета, при острых и затяжных пневмониях, бактериемии),
4) смывы с бронхоскопа, БАЛ, биоптаты.
Helicobacter pylori - поражения ЖКТ: гастриты, язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки и др. 1) Желудочный сок, мазок из зева натощак, зубной налет,
2) Смыв с наконечника эндоскопа, биоптаты,
3) фекалии.

 

Вернуться